Microbiologia generale

MISURAZIONE DELLA MASSA CELLULARE:

VALUTAZIONE DELLA TORBIDITA’ tramite lo

spettrofotometro che misura la densità ottica

(OD=-logT) direttamente proporzionale alla

massa cellulare. La trasmittanza (T) diminuisce

all’aumentare del numero di cellule.

MISURA DELLA MASSA CELLULARE:

DETERMINAZIONE DEL PESO SECCO è un

metodo indiretto per valutare la crescita

microbica attraverso la determinazione del peso

delle cellule presenti in un dato volume di liquido:

Cellule centrifugate per eliminare il brodo colturale

 Pellet cellulare posto su un piattello tarato

 Uso di una stufa a 105°C

 Valutazione del peso (costante)



Questo metodo è utilizzato prevalentemente per muffe, che essendo

filamentose rendono l’applicazione degli altri metodi difficoltosa.

Aspetti quantitativi della crescita batterica

Considerando cellule che si

riproducono per scissione binaria, la

crescita batterica può essere espressa in funzione del tempo secondo la

2n

seguente equazione: Nt = N0 x

Dove: N0 numero batteri inoculati

 Nt numero di batteri al tempo t

 n è il numero di generazioni

 Velocità di crescita: variazione del numero di cellule o della massa per

 unità di tempo

Generazione: intervallo di tempo durante il quale da una singola cellula di

 formano 2 cellule figlie (g)

Tempo di generazione: tempo necessario per una cellula per duplicarsi

 

Quanto impiega una cellula a dividersi? consideriamo una fase esponenziale

(log): fase in cui i batteri si accrescono alla velocità massima. Il numero di

batteri raddoppia ad intervalli regolari di tempo (v costante).

Curva di crescita batterica

La velocità di crescita di un determinato microrganismo in ambito artificiale

(non naturale) non è costante ma dipende da: ambiente e condizioni di

crescita. La crescita di una coltura batterica è caratterizzata dalla successione

di quattro fasi. Conoscere queste fasi è utile per sapere quando prelevare: la

fase migliore è quella di crescita esponenziale. La coltura in batch avviene in

un sistema chiuso fino ad esaurimento dei nutrienti e con conseguente

accumulo dei prodotti di rifiuto, vengono lasciati incubare per circa 24-48 h.

FASE DI LATENZA (lag)

corrisponde ad una fase di

adattamento dei microrganismi

al mezzo di coltura; in questa

fase la crescita è considerata

pari a zero. La presenza di

questa fase di latenza è

influenzata prevalentemente da

due fattori: in primis dallo stato

fisiologico delle cellule, infatti

se vengono prelevate in fase

stazionaria devono ripristinare il loro apparato metabolico; è inoltre influenzata

dal tipo di terreno colturale, infatti se la fonte di C del terreno è una fonte non

prontamente assimilabile, le cellule devono sintetizzare enzimi inducibili.

FASE ESPONENZIALE (log) è ina fase durante la quale i microrganismi si

accrescono alla velocità massima. Si accumulano metaboliti primari, ovvero i

prodotti del metabolismo cellulare (es. acido lattico nel caso dei batteri lattici).

La velocità può essere influenzata da concentrazione, sostante nutritive, pH,

forza ionica e temperatura. Se aumento troppo le sostanze nutritive si rischia di

avere fenomeni di inibizione anziché di crescita.

FASE STAZIONARIA la mancanza di nutrienti e l’accumulo di metaboliti,

possono variare le condizioni ambientali ottimali rallentando così la crescita

fino ad azzerarla (v=0). In questa fase il numero di microrganismi rimane

costante ed, inoltre inizia un processo di sporificazione-produzione di metaboliti

secondari (es. antibiotici).

FASE DI MORTE il numero di cellule vitali

decresce in modo esponenziale (ma l’andamento

della curva dipende dal metodo di conta

utilizzato). Anche se il numero di cellule vitali può

diminuire, la biomassa potrebbe rimanere

costante per un periodo più o meno lungo, seguito

da una fase di lisi, con rilascio di materiale

cellulare nel mezzo.

Sapere mettere appunto una curva di crescita

tramite metodi di conta è fondamentale. Se

vogliamo sapere il numero di patogeni presenti

non bisogna considerare solo il numero di cellule vive ma anche quello delle

cellule morte perché alcuni di essi possono rilasciare tossine prima di morire.

SE il terreno contiene due fonti di carbonio, una prontamente assimilabile (es.

glucosio) e una inducibile (es. lattosio) si ha una crescita detta “diauxica”.

I virus

I virus sono stati scoperti in tempi recenti (19° secolo); la loro esistenza e le

loro caratteristiche sono state infatti solo inizialmente dedotte. La difficoltà di

studio risiedeva nel fatto che questi agenti infettivi non potevano essere isolati

in coltura pura e avevano dimensioni così piccole da non essere visibili al

microscopio ottico. Bisognava attendere l’avvento della microscopia elettronica

(negli anni 50-60).

Caratteristiche generali

Entità biologiche subcellulari con dimensioni dell’ordine dei nm (agenti

 filtrabili)

Parassiti endocellulari obbligati (non possono produrre energia o

 sintetizzare acidi nucleici e proteine al di fuori di una cellula ospite).

Devono cioè utilizzare i meccanismi della cellula ospite per produrre i

propri componenti (mRNA virali, proteine e copie identiche del genoma)

Possiedono un solo tipo di acido nucleico (DNA o RNA) che deve

 codificare proprie proteine specifiche per ogni processo da loro richiesto e

non effettuabile dalla cellula

Possiedono un involucro proteico (capside) e, a volte, un involucro

 lipoproteico (pericapside o peplos)

Presentano in superficie strutture proteiche (antirecettori) che si legano a

specifici recettori della cellula bersaglio. Ne consegue una elevata specificità

d’ospite: virus animali, virus animali, virus batterici (batteriofagi)

Possiamo riassumere la struttura del VIRUS

come una INFORMAZIONE GENETICA

(genoma virale) , in forma di DNA o RNA

contenuta in un capside (costituito da

subunità proteiche denominate capsomeri)

il quale ha una funzione di protezione del

genoma virale e di conferimento di una

specifica forma. A sua volta il capside può

essere avvolto eventualmente da un pericapside (lipoproteico). Il pericapside

può essere presente o meno ma non si tratta di una componente facoltativa,

quando è presente è fondamentale per il virus.

I virus non possono produrre energia o sintetizzare acidi nucleici e proteine al di

fuori di una cellula ospite; devono utilizzare i meccanismi della cellula ospite

per produrre i propri componenti.

Sulla superficie sono presenti strutture proteiche (antirecettori) che si legano a

specifici recettori della cellula bersaglio. Ne consegue un’elevata specificità

d’ospite: virus animali, virus batterici (batteriofagi).

La cellula virale completa si chiama VIRIONE; è costituita da genoma virale che

è formato dall’acido nucleico incluso in un capside. Il capside ha funzione di

protezione del genoma virale e conferisce una specifica forma. I virus si

possono classificare in base alle dimensioni e forma; tipo di acido nucleico

(DNA o RNA) e tipo di replicazione (nucleare o citoplasmatica dove avviene

l’infezione). In basse alla struttura si dividono in:

Virus rivestiti: il virus è inglobato



all’interno di un involucro esterno, ovvero

una membrana (pericapside), costituita da

lipoproteine e fosfolipidi e deriva dalla

membrana della cellula ospite di cui il

virione completo si circonda quando

fuoriesce dalla cellula (HIV).

VIRUS a simmetria ELICOIDALE: il



capside è costituito da una spirale di

proteine che si avvolge in senso antiorario.

Il genoma forma una spirale all’interno del

capside ed è contenuto in una specie di

doccia situata sulla parte superiore della

proteina. A centro del virus è presente un tubicino con enzimi e matrice

proteica.

VIRUS a simmetrica ICOSAEDRICA: il



capside assume la forma di un icosaedro

regolare (20 facce a triangolo equilatero).

Ogni faccia è costituita da proteine sferiche

adiacenti, unite in gruppi di 5/6 unità

(capsomeri). Il genoma si trova all’interno

del capside, unito spesso a proteine

particolari che formano la matrice. Il

materiale proteico può essere presente anche all’interno del capside.

VIRUS a simmetria COMPLESSA



(batteriofagi): il capside è ben strutturato,

può essere un capside di forma ben definita

o un capside asimmetrico. Questi virus sono

costituiti da una testa con all’interno il

genoma virale, la coda è costituita da

proteine, all’interno è cavo e termina con delle fibre più o meno lunghe

per l’adesione.

Ciclo replicativo (ciclo litico)

Un virus per riprodurre se stesso infetta una cellula e deve volgere delle azioni

specifiche. Queto processo ha due fasi: la fase precoce e la fase tardiva.

Fase precoce: adsorbimento, penetrazione e replicazione del genoma virale.

Fase tardiva: replicazione dei componenti strutturali del virus, assemblaggio dei

componenti virali (maturazione) e rilascio della cellula ospite.

FASE PRECOCE è a sua volta divisa in più sottofasi:

Adsorbimento fase durante la quale avviene il riconoscimento e attacco

1. del virus alla cellula bersaglio. Si ha un legame tra la struttura virale e la

membrana cellulare, inoltre il genoma virale ha le informazioni che

permettono di modificare il normale metabolismo cellulare. È la fase più

importante e l’infezione è irreversibile. In particolare avviene

un’interazione stereochimica tra specifici gruppi chimici esposti sulla

superficie esterna della cellula suscettibile (recettori) e del virione

(antirecettori). Il processo di adsorbimento richiede solo una

partecipazione passiva della cellula.

Penetrazione per i diversi virus animali e vegetali può avvenire per:

2. endocitosi o fusione. L’endocitosi è un processo che consiste

nell’adesione del virus sulla membrana della cellula ospite e ne provoca

l’introflessione che trasporta il virus nel citoplasma, racchiuso in un

vacuolo fagocitario (virus nudi, virus con involucro). Nella fusione, invece

l’involucro lipoproteico del virus si fonda con la membrana citoplasmatica

(lipoproteica). Il nucleocapside entra nel citoplasma. Per quanto riguarda

i batteriofagi, la struttura rimane all’esterno, mentre penetra sono il

genoma. In seguito alla

penetrazione del genoma virale

o alla degradazione del capside

ad opera di proteine

enzimatiche cellulari e virali,

l’acido nucleico libero nel

citoplasma può diri