Lezioni Genetica - parte 2

MODELLO SEMICONSERVATIVO

Secondo il modello semiconservativo partendo da una doppia elica parentale si ottengono delle molecole

figlie, in cui una delle due eliche costituenti la doppia elica parentale è di origine parentale e l’altra è di neo-

sintesi. Si ottiene una prima generazione in cui la doppia elica parentale si separa, è un’elica che fa da

stampo per costituire un'elica di neo-sintesi, anzi ciascuna delle due doppie eliche fa da stampo per

costituire un’elica di neo-sintesi. Semiconservativo significa che si conserva metà della doppia elica. Alla

seconda generazione ciò che si ottiene dalla prima generazione è il nuovo parentale, per cui una delle due

doppie eliche risulta con il nome parentale, e fa da stampo a una nuova elica, mentre quella parentale

iniziale nuova fa di nuovo da stampo per un'altra elica.

MODELLO CONSERVATIVO

L'intera doppia elica parentale rimane così com'è e si ricostituisce identica. Sulla base di questa si

ricostruisce una copia nuova identica tutta di neo-sintesi. L'elica parentale rimane intatta, non si separa e

viene copiata in una nuova doppia elica interamente di neo-sintesi, e così a tutte le altre generazioni.

In pratica la molecola parentale rimane invariata di generazione in generazione

MODELLO DISPERSIVO

Secondo il modello dispersivo in maniera casuale a tratti la doppia elica parentale viene mantenuta, e la

nuova doppia elica alla prima generazione è costituita parzialmente da porzioni della doppia elica parentale

seguite da porzioni di neo-sintesi. La doppia elica si rimescola a tratti. Si vengono a creare delle doppie

eliche date da un mix di doppie eliche parentali e di neo-sintesi in maniera casuale.

Il metodo usato nell’esperimento:

– NB Viene trattato il DNA con due isotopi di N: 15N più pesante e 14N più leggero. In base all’isotopo di

azoto usato la molecola ha un certo grado di densità, e sulla base di questo va a sedimentarsi diversamente

in un gradiente di cesio cloruro; si vanno a

ottenere molecole di DNA con densità diversa,

che hanno un punto di equilibrio diverso in un

gradiente di Cesio Cloruro.

Molecole di DNA contenenti 15N va a

sedimentare sul fondo della provetta in quanto è

più pesante, mentre la molecola con 14N

galleggia più superficialmente in tale gradiente, e

ha un punto di equilibrio più alto.

• E. coli viene cresciuto per molte generazioni con 15N come unica fonte di azoto. In questo modo il DNA

della cellula è più “pesante” del normale a causa dell’isotopo 15N. La molecola di DNA è formata solo da

15N.

• Si passano poi le cellule in 14N

• Si isola il DNA a vari intervalli di tempo e lo si separa per centrifugazione in gradienti di densità. Sono

andati a vedere cosa succedeva durante le replicazioni.

Risultati e Interpretazione

1) L'inizio dell'esperimento è costituito dalla crescita di E. Coli in un terreno contenente come unica fonte di

azoto 15N, facendo una centrifuga del DNA in un gradiente di cesio cloruro si è ottenuto un'unica banda di

DNA sul fondo della provetta, corrispondente al punto di equilibrio dell'azoto pesante. Possiamo

identificare questa doppia elica come la doppia elica parentale pesante interamente costituita da 15N.

2) A questo punto trasferisco in 14N, la provetta diventa blu. Facciamo un primo ciclo di replicazione e

otteniamo un'unica banda in gradiente di cesio cloruro che ha un livello di densità più leggero rispetto al

precedente ma più pesante rispetto ad una molecola interamente costituita da 14N. Si ottiene una doppia

elica che va a trovare un punto di equilibrio intermedio fra la banda di 15N e la banda di 14N. Questa banda

intermedia indica che il DNA è per

metà costituito da 15N e per metà

→

costituito da 14N. Esclude il

modello conservativo perché non

avrei mai ottenuto una molecola

mix costituita a metà da 15N e metà

da 14N, ma il modello dispersivo

non si può escludere perché ad un

primo ciclo di replicazione avrebbe

dato un punto intermedio. Ho

ottenuto un ibrido, costituito da una

molecola parentale e da una elica di

neo-sintesi (interamente di 14N)

3) Al secondo ciclo di replicazione,

ancora in 14N, ottengo dopo la

centrifugazione in gradiente di cesio

cloruro, due bande, una prima

banda identica alla prima banda

ottenuta al primo ciclo di

replicazione, alla stessa altezza

perciò intermedia tra la banda di

14N e la banda di 15N, e una seconda banda più leggera corrispondente all’altezza di una molecola

interamente costituita da 14N. La doppia elica diventa la doppia elica parentale, i due filamenti si separano

e ciascuno dei due funge da stampo per una nuova catena di neo-sintesi; il filamento rosa (15N) funge da

stampo e la catena di sintesi ottenuta copiando il filamento rosa va a costituire un DNA ibrido costituito da

azoto 15 e 14. L'altra catena, che era costituita da azoto 14, diventa a sua volta parentale e funge da

stampo per una nuova elica di neo-sintesi, anch'essa costituita da 14N. Si viene a creare una doppia elica

interamente costituita da 14N, quindi avrà un punto di galleggiamento corrispondente ad una doppia elica

che contiene solo 14N e che non contiene per niente 15N.

4) Al terzo ciclo di replicazione la molecola leggera si separa completamente, si ottengono due doppie

eliche ancora una volta interamente costituite da 14N. La catena ibrida che si era formata si separa

nuovamente, si ricrea la stessa situazione del secondo ciclo, una doppia elica mix 14N/15N e una di nuova

sintesi. La banda intermedia dell'ibrido 14N/15N rimane ancora presente. Questo non è compatibile

neanche con il modello dispersivo perché se fosse giusto mano a mano che vado avanti con le generazioni

la catena diventerebbe sempre più leggera, si avrebbe sempre di più una preponderante presenza di 14N

rispetto a 15N, quindi la doppia elica dovrebbe piano piano alleggerirsi e la banda non dovrebbe rimanere

fissa sul l'ibrido 14N/15N ma dovrebbe a mano a mano diventare sempre più leggera incorporando sempre

più una quantità maggiore di 14N. Ma invece non si verifica, si mantengono due bande ad altezze fisse, una

quella dell'ibrido e una quella interamente costituita da 14N.

Questo esperimento ha dimostrato che l'unico modello compatibile è il modello semiconservativo.

• 1953 James Watson e Francis Crick risolvono la struttura del DNA

• 1958 Meselson e Stahl dimostrano che la replicazione del DNA è semi-conservativa

• Dal 1959 questi meccanismi sono universalmente accettati

L'esperimento di Meselson e Stahl era stato condotto su E. Coli; quindi, resta da dimostrare che anche negli

eucarioti la replicazione avvenga in modo semiconservativo.

Un primo esperimento, quello di Taylor, è stato fatto su delle cellule dell’apice radicale della Fava. Hanno

fatto crescere queste cellule in un terreno di cultura che contenesse la Timidina triziata (marcata). Una

volta fatte crescere queste cellule in questo terreno sono state trasferite in un terreno contenente la

timidina normale e l’alcaloide colchicina, che serve per impedire la formazione delle fibre del fuso. Questo

passaggio non aveva nessuna funzione specifica per l'esperimento,

ma semplicemente serviva per non far separare tra di loro i cromatidi

fratelli all'anafase. Questo pure non alterando l'esperimento andava

ad agevolare la conta del numero di cromosomi, cioè la presenza di

questa colchicina fa sì che il numero di cromosomi raddoppia ad ogni

ciclo cellulare e che si possa andare a contare questo numero di

duplicazioni.

Inizialmente le cellule sono state fatte crescere in presenza di

timidina marcata; quindi, si sono ottenute delle cellule interamente in

nero (a). Successivamente le cellule sono state trasferite in presenza

di timidina non marcata, quindi è stata fatta fare una duplicazione

senza la presenza di timidina marcata, e si è potuto osservare che si

ottenevano, dopo la marcatura, dei cromosomi che erano costituiti

per metà da timidina marcata e per metà di timidina non marcata (b).

Il modello semi conservativo è stato dimostrato valido anche per gli

eucarioti facendo un esperimento di marcatura del tutto simile a

quello di Melseson e Stahl, e si è potuto vedere che anche nei

cromosomi eucariotici si otteneva non una dispersione della

marcatura, ma che il cromosoma figlio rimaneva marcato e che l'altro cromosoma di neo-sintesi rimaneva

non marcato.

In realtà questo esperimento ha fatto una scoperta in più che riguarda gli scambi tra cromatidi fratelli

avvenuti in mitosi. Fondamentalmente sono degli interscambi di DNA prodotto durante la replicazione in

cromosomi che sono del tutto identici, sono scambi di materiale genetico avvenuto durante la mitosi che

non modificano in nessun modo il cromosoma perché non è uno scambio tra cromosomi omologhi come il

Crossing over ma è uno scambio tra cromatidi che sono uno la copia dell'altro, quindi si scambia DNA

identico.

Altro esperimento:

È stato fatto sulle cellule ovariche di criceto. Alle cellule viene aggiunto un

analogo della Timina, la 5- Bromodesossiuridina (BUdR); il vantaggio è dal

punto di vista della colorazione. Si va a fare una crescita in BUdR nel terreno

per due cicli replicativi

• poi si va a fare una colorazione perché nel momento in cui i cromosomi

vengono colorati con il colorante Giemsa i cromosomi che avevano

incorporato la BUdR risultano più chiari rispetto a quelli senza che non la

contengono

• Si ottengono dei cromosomi che vengono definiti “Arlecchino”

• vado ad incorporare la BUdR, e al primo ciclo di replicazione abbiamo che i

cromosomi vanno a emettere una fluorescenza meno intensa rispetto a

quelli che non la avevano. A mano a mano che incorporò più BUdR, i

cromosomi risultano sempre più chiari. Quindi questi cromosomi sono

stati chiamati cromosomi arlecchino perché si presentano in due

aspetti: al primo ciclo tutti sfumati (perché ciascuna delle due doppie

eliche che andava a costituire i cromatidi di questo cromosoma

conteneva per metà BUdR e per metà non la conteneva, quindi aveva

un aspetto completamente strisciato), mentre al secondo ciclo di

replicazione uno dei due cromatidi fratelli era interamente costituito

da una doppia elica contenente solo BUdR e quindi era totalmente

chiaro, si ottenevano quindi i cromosomi

metà bianchi e metà neri dovuti alla

presenza e assenza di BUdR.

• Andando avanti con gli esperimenti si è visto che, esattamente come

avevano intuito Meselson e Stahl, le doppie eliche che avev