Appunti lezioni Genetica molecolare

PCR).

Componenti:

- Primer casuali (9-meri degenerati): corti pezzi di DNA che si legano ovunque.

- DNA Polimerasi Klenow: una forma modificata della DNA polimerasi I che:

non ha attività esonucleasica

o sintetizza solo (attività polimerasica 5’→3’)

o

Risultato: si ottiene un mix di piccoli frammenti tutti marcati, usati come sonde.

Si usa quando la sonda è troppo corta per essere trattata con DNasi (che la distruggerebbe tutta).

DOP-PCR (Degenerate Oligonucleotide-Primed PCR) è una tecnica simile alla random priming, ma usata per

amplificare il DNA genomico in modo casuale.

Come funziona: Usa primer degenarati (cioè con sequenze parzialmente casuali) e permette di amplificare

sequenze sconosciute o di produrre una libreria di frammenti eterogenei del genoma.

Similitudine con random priming:

Entrambe usano primer degenerati per riconoscere più punti del DNA e amplificare regioni diverse.

Oltre alle marcature di tipo enzimatico si posso usare anche quelle chimiche – ci solitamente kit commerciali

con molecole come un atomo di platino che si lega all’azoto della guaina in 6.

MICROSCOPIO OTTICO A FLUORESCENZA: possono essere usate lampade a vapori o lampade a fibre ottiche

(emettono un fascio di luce che passa attraverso un filtro di eccitazione che attraverso lo specchio dicroico

viene deviato attraverso l’obbiettivo e sul vetrino) – sul vetrino sono presenti molecole fluorescenti che una

volta eccitate emettono fluorescenza che attraverso il filtro di emissione e puo essere rilevata mediante gli

oculari o tramite fotocamera – le immagini verrano elaborate da computer.

Ogni fluorocromo ha uno spettro di eccitazione e uno di emissione – se nello stesso esperimento si utilizzando

piu fluorocromi serve sceglierli in modo che lo spettro di emissione non sia sovrapposto per distinguere il

segnale emesso da uno piuttosto che da un altro.

Il microscopio a fluorescenza è corredato da filtri specifici per i fluorocromi utilizzarli per visualizzare la sonda

e in piu è attaccato una fotocamera che è capace di visualizzare l’immagine trasmetterla ad un computer come

immagine bianco e nero.

Applicazioni della fish:

- identificazione delle anomalie di numero – in questo caso non si utilizzano le metafasi ma i nuclei in

Interfase

- Identificazione di riarrangiamenti strutturali (micro delezioni, duplicazioni, traslocazioni criptiche,

inversioni o cromosomi marcatori o ad anello)

- Mappaggio cromosomico di una regione specifica (localizzazione di sequenze specifiche geniche su

specifici cromosomi)

Le sonde: si possono usare diversi tipi di sonde

- Chromosome painting: sonde di dna costituite da un’ampia collezione di frammenti differenti e

derivanti da un unico cromosoma e quindi vanno a colorare interamente il cromosoma. Inizialmente

venivano costruite a partire da librerie genomiche plasmidi che cromosoma specifiche – si aveva una

libreria formata da una collezione di plasmidi ciascuno dei quali presentava un frammento di dna che

proveniva da uno specifico cromosoma. Però quando si costruisce una libreria si tendono a perdere i

frammenti clonati nei plasmidi percio non sono state più utilizzate queste librerie nel tempo.

- Flow sorting: painting cromosme specifiche – permette di isolare specifici cromosomi e di marcarli con

DOP-PCR. Le cellule vengono bloccate in metafase. Si rompe la membrana plasmatica → si ottiene una

sospensione di cromosomi. I cromosomi vengono colorati con fluorocromi che si legano al DNA.

Quando colpiti da due raggi laser, emettono fluorescenza diversa a seconda del contenuto in AT e GC e

della dimensione. Vengono separati da piastre di deflessione e raccolti individualmente.

Produzione della sonda: Si recuperano circa 300 cromosomi specifici. Si amplificano con DOP-PCR,

aggiungendo fluorocromi → si ottiene la sonda marcata. Si va poi a costruire un grafico dove si vede la

separazione dei diversi cromosomi in base al loro contenuto di CG e AT e la loro grandezza – ogni spot

rappresenterà un singolo cromosoma.

- Ibridi somatici uomo-hamster, amplificano con sequenze Alu che sono proprie della specie umana ma

non sono presenti nel topo in cui è stato costruito l’ibrido

- Microdissezione, l’intero cromosoma o un frammento viene sottoposto a DOP-PCR – si utilizza un

microscopio a cui è attaccato un micro manipolatore che stacca pezzi di cromosoma recuperandone

diverse parti per poi esser marcato con DOP-PCR.

Le cromosome painting vengono utilizzate per confermare sospetti di diagnosi.

RIASSUNTO

COSA SONO LE SONDE CROMOSOMICHE (chromosome painting)

Le sonde sono frammenti di DNA che si usano per identificare e “visualizzare” specifiche sequenze o interi

cromosomi in un campione di DNA o in una cellula. Funzionano per complementarietà: la sonda si lega alla

sequenza bersaglio perché è complementare (come avviene nei filamenti di DNA).

Chromosome painting

È una tecnica della FISH (ibridazione in situ fluorescente) in cui si usano sonde che riconoscono un intero

cromosoma.

COME FUNZIONANO QUESTE TECNICHE

Obiettivo: costruire una sonda che “colora” uno specifico cromosoma, per farlo, bisogna prima isolare il DNA

di quel cromosoma → amplificarlo → marcarlo con un fluorocromo.

Metodo 1: Chromosome Painting da librerie genomiche plasmidiche (oggi non più usato):

Si creavano librerie: frammenti di un cromosoma venivano inseriti in plasmidi. Ma frammenti grandi si

perdevano, e si finiva con sonde poco specifiche, arricchite in sequenze ripetute → abbandonato.

Metodo 2: Flow Sorting + DOP-PCR (tecnica moderna e usata)

Step:

1. Blocco cellulare in metafase: i cromosomi sono ben visibili.

2. Si rompono le cellule → ottieni sospensione di cromosomi.

3. Colorazione con fluorocromi: si legano al DNA.

4. I cromosomi vengono colpiti da due laser e analizzati per contenuto in AT/GC e dimensione

5. Vengono separati (sortati) tramite deflessione elettrostatica → raccolti.

6. Amplificazione del DNA di quel cromosoma con DOP-PCR

7. Marcatura con fluorocromi → ottieni la sonda painting.

Alla fine ottieni un grafico (flow karyotype) dove ogni spot è un cromosoma.

Metodo 3: Ibridi somatici uomo-criceto + Alu-PCR :Si creano cellule ibride contenenti solo alcuni cromosomi

umani e si fa PCR con sequenze Alu, presenti solo nel genoma umano. Si amplifica quindi solo il DNA umano,

che si può usare per fare la sonda.

Metodo 4: Microdissezione cromosomica: Tecnica fisica: si usa un microscopio con micromanipolatore. Si

“stacca” un cromosoma o un suo frammento da un vetrino e si amplifica con DOP-PCR e si marca → ottieni la

sonda.

COME SI USANO QUESTE SONDE?

1. Si prepara un vetrino con i cromosomi del paziente (cellule in metafase).

2. Si denatura il DNA (cioè si separano i filamenti).

3. Si aggiunge la sonda marcata → si ibrida con la sequenza complementare.

4. Si osserva al microscopio a fluorescenza: dove la sonda si lega, appare il segnale (colorato).

Il painting e i tumori: sono molto importanti per l’identificazione di riarrangiamenti in tessuti tumorali; ad

esempio lo possiamo vedere nella traslocazione complessa in leucemia mieloide acuta (AML), infatti

analizzando le metafasi dei pazienti che avevano questa malattia si è notata una traslocazione che coinvolgeva

3 cromosomi (8,13 e 14).

Reverse painting: utilizzata per identificare materiale cromosomico di origine sconosciuta – lo usi come sonda

su un cromosoma noto, perciò isoli il cromosoma anomalo partendo da un paziente con un cromosoma

strutturalmente alterato e lo microdissezioni – poi viene amplificato mediante DOP-PCR e durante l’

amplificazione si inseriscono i cromosomi alterati fluorescenti cosi da creare una sonda fluorescente che

rappresenta tt il dna del cromosoma anomalo – dopo di cui si ibrida questa sonda con le cellule in metafase e

si legherà solo ai cromosomi da cui deriva.

In genetica si usano anche sequenze ripetute, in particolare quelle che riconoscono il centromero – infatti

molte sequenze centromeriche (dna alfoide) nonostante siano ripetute riconoscono in maniera specifica i

singoli cromosomi. C’è un higher order repeats che rende cromosoma specifiche queste sequenze ripetute. A

differenza delle altre specie queste sequenze sono specifiche per ogni cromosoma per la maggior parte – sono

costituite da ripetizioni di 171 basi ripetute in modo specifico per ogni cromosoma.

Esistono due diversi approcci per ibridare tutti i cromosomi mediante painting

- Multicolor fish, si utilizza per ciascuna sonda la marcatura con una diversa combinazione di

fluorocromi (utilizzando 5 filtri diversi si fotografano le metafasi per ciascun cromosma) – sono utilizzati

6 fluoroscomi compreso dapi e ogni sonda viene marcata con uno o piu fluorocromi. Viene poi ripersa

l’immagine si osserva come è colorato ogni cromosoma. Si utilizza anche su metafasi tumorali.

- Sky, ciascun cromosoma marcato con una combinazione diversa di fluorocromi ma non vengono usati

diversi filtri per identificare i 5 spettri emessi ma vengono valutati tutti gli spettri di emissione pixel per

pixel e il risultato finale è lo stesso

In entrambe le tecniche si usano 24 sonde painting in fluorescenza per tutti i cromosomi.

SONDE LOCUS SPECIFICHE: altro tipo di sonde che viene utilizzata in laboratorio di citogenetica – permettono

di evidenziare la presenza di una regione cromosomica riarrangiata (ce una sonda che deve riconoscere la

regione su cui sto indagando e una sonda che viene sempre associata alla prima come controllo). In

diagnostica vengono utilizzate sonde commerciali e non è possibile usare altre sonde, in ricerca invece è

possible usare altre sonde e in base alla regione che si vuole indagare si usano diverse sonde che solitamente

vengono clonate in diversi vettori (i più usati sono i BAC) pagina 63 potrebbero mancare un paio di pt importanti

ma sono piena

Esistono sonde che contengono singole sequenze e vengono utilizzate per l’identificazione di riarrangiamenti

sub microscopici, come micro delezioni, traslocazioni criptiche subtelocentriche, micro duplicazione (anche

se sono difficili da identificare se sono in tandem) e traslocazioni.

Fish ci permette di:

1. Confermare una diagnosi clinica – ad esempio la sindrome di Wolf-Hirschhorn è dovuta alla perdita

parziale o totale del braccio corto del cromosoma 4. In alcuni casi la delezione riguarda solo la zona

critica della sindrome che pero non è identificabile tramite bendaggio ed è questo il caso in cui bisogna

utilizzare fish. Ci sono altre sindromi che sono caratterizzate da maggiore instabilità e che hanno

microarrangiamenti strutturali che vanno a coinvolgere regioni specifiche. S i tratta spessi di casi

sporadici e possono essere sia riarrangiamenti ricorrenti che non; sono definiti ricorrenti quando la