Lezioni Microbiologia - parte 2

GENOMA DEGLI ARCHEA

-la modalità di replicazione e di espressione dei geni, trascrizione e traduzione, sono semplici ma più simili a

ciò che succede negli eucarioti

-il cromosoma degli archea generalmente è una molecola circolare anche se ci sono specie che possiedono

più di un cromosoma (come nei batteri)

-gli archea, a differenza dei batteri, possiedono gli istoni, quindi formano una struttura che è simile a quella

del nucleosoma nelle cellule eucarioti. Sono presenti anche altre piccole proteine che contribuiscono a

compattare il DNA in quanto si legano direttamente alla doppia elica del DNA

-le dimensioni del genoma vanno da 0.5 Mb fino a 5.5 Mb

-ma come negli eucarioti, anche nel genoma degli archea possiamo talvolta trovare gli introni. Per

l'espressione di geni che contengono questi introni, anche negli archea sarà presente un meccanismo di

splicing che permette di eliminare gli introni e di riunire gli esoni

Tipologie di mutanti batterici. Come possono essere isolati? Come sono utili per ricostruire la via

biosintetica di un determinato prodotto?

A sinistra mostra come possono insorgere mutazioni sapendo che la cellula batterica possiede dei sistemi di

riparazione dei danni che il DNA può subire. Qualora la cellula non riesca a riparare questi danni può anche

andare incontro alla morte. A partire dal DNA, la replicazione può avvenire in maniera fedele al 100% e non

si instaurano mutazioni oppure possono avvenire degli errori di appaiamento, che possono portare

all'insorgenza di mutazioni che possono essere corrette e riparate, oppure che possono rimanere come tali

ed indurre la formazione di mutazioni. La frequenza di mutazione è bassa, ma possiamo aumentarla se

trattassimo la nostra cellula con agenti chimici come la nitrosoguanidina o con agenti fisici come i raggi

ultravioletti. Se le mutazioni sono in geni i cui prodotti sono essenziali per la vitalità della cellula questo

porta alla morte

della cellula

stessa, ma

possono essere

riparati da questi

diversi

meccanismi e

quindi la cellula

può

sopravvivere,

può moltiplicarsi

ma ovviamente

ha una

mutazione.

Tipi di mutanti batterici

-mutanti morfologici: possono riguardare la tipologia di colonie oppure la tipologia di cellule. Se parliamo

di colonie è importante un ceppo streptococcus pneumoniae che presenta colonie liscie o colonie rugose.

Le colonie erano lisce perché è un patogeno quindi è caratterizzato dalla presenza della capsula di natura

saccaridica e conferisce l'aspetto liscio alle colonie. Se il ceppo white type perde la capacità di sintetizzare la

capsula, le sue colonie appaiono rugose e non più lisce. Per quanto riguarda la cellula, per esempio a forma

di bastoncino, otteniamo un mutante che quando andiamo a colorarlo con la colorazione di gram non

appare più con la forma a bastoncino ma osserviamo la presenza di lunghi filamenti, si può ipotizzare che ci

sia un difetto nella divisione cellulare, per cui durante il processo le cellule figlie non riescono più a

separarsi ma rimangono riunite in un filamento. Poi ci sono cellule dotate di flagello, e se lo perdono

diventano immobili.

-mutanti resistenti: agli antibiotici, ai metalli pesanti, alle infezioni da parte di batteriofagi. Come

acquisiscono la resistenza? nel caso dei batteriofagi: in prima fase comincia a muoversi sulla superficie della

cellula batterica per cercare e vedere se c'è il recettore specifico, se lo trova si lega ad esso e inizia il suo

processo di infezione. Ma una mutazione nel gene che codifica il recettore batterico può causare la

modificazione del recettore stesso per cui il batteriofago non lo riconosce e quindi non può infettare la

cellula batterica, che è quindi diventata resistente.

-mutanti nutrizionali: sono presenti due tipologie. Per esempio, un batterio che è in grado di utilizzare

come fonte di carbonio e di energia lo zucchero a. A seguito di una mutazione di uno dei geni che

codificano gli enzimi coinvolti nel metabolismo di questo zucchero, la cellula batterica può perdere la

capacità di utilizzare quello zucchero.

-i mutanti nutrizionali o auxotrofi: ceppo batterico che ha perso la capacità di sintetizzare i fattori

nutrizionali, come la capacità di sintetizzare un amminoacido. Il ceppo white type, quindi capace di

sintetizzare tutti i fattori nutrizionali che servono per la crescita, prende il nome di prototrofo. Invece

auxotrofo è un mutante che deriva da un prototrofo e che ha perso la capacità di sintetizzare un fattore di

crescita

-mutanti letali condizionali: sono termosensibili, per esempio il batterio white type può crescere in un

range di temperatura tra 20 e 45°C, il mutante che si può ottenere può crescere per esempio al 30-32°C ma

non a 42°C. Mutanti di questo tipo possono essere causati da mutazioni in proteine o in enzimi che a

seguito di questa mutazione non sono più in grado di funzionare a 42°C.

I mutanti possono anche essere isolati nel caso dei batteriofagi:

-i batteriofagi virulenti infettano la cellula batterica, si moltiplicano all'interno di essa e ad un certo punto la

cellula lisa e muore. Questi mutanti possono causare una lisi molto veloce della cellula batterica

-quando una cellula batterica è infettata da un batteriofago e lisa, sulla piastra in cui seminiamo la miscela

di cellule più il batteriofago, dopo un periodo

di incubazione opportuno, vediamo lo

sviluppo delle placche di lisi che possono

avere dimensioni diverse. I mutanti dei

batteriofagi possono presentare sviluppare

placche molto piccole.

Come si isolano i mutanti?

-metodo diretto: viene utilizzato per ottenere mutanti resistenti agli antibiotici. nel caso di questi mutanti

si possono osservare due tipologie di resistenze, one step, con un passaggio solo riusciamo a ottenere

mutanti resistenti all'antibiotico, e multi step, in cui servono diversi passaggi per riuscire a ottenere un

mutante resistente.

→one step: l'obiettivo è quello di ottenere un mutante resistente, per esempio la streptomicina. Devo

avere a disposizione una coltura del ceppo white type, e di questo ceppo devo conoscere la MIC (quantità

più piccola di antibiotico necessaria per inibire la crescita o uccidere il batterio). Il ceppo white type potrà

avere una MIC, per esempio pari a 4 mg x ml di coltura. Se voglio isolare un mutante resistente a questo

antibiotico, nel caso della streptomicina, siccome la frequenza di

mutazione è molto bassa io devo seminare una quantità molto

elevata di cellule del ceppo white type in un terreno solido che

contiene una quantità di antibiotico che sia almeno 10 volte

superiore alla MIC del ceppo white type. Quindi preparerò delle

piastre con 40 mg x ml di streptomicina. poi vado ad incubare e

osserverò lo sviluppo di poche colonie, che poi sono in grado di

crescere su una quantità così elevata di antibiotico, e quindi sono

resistenti a quell'antibiotico.

→ multi step: per esempio nel caso di mutanti resistenti alla

penicillina. se noi abbiamo il nostro ceppo con una MIC di 2 mg x ml

preparo piastre con una concentrazione di antibiotico di un 1 mg x

ml, cresceranno delle colonie e le trasferirò in un terreno che

contiene 4 mg x ml di penicillina. Prendo le colonie, le metto nel

liquido e le semino. Aumento gradualmente la quantità di antibiotico nel terreno. Dopo una serie di

passaggi riesco ad ottenere un mutante resistente.

Come faccio ad isolare un mutante auxotrofo, per esempio, per la sintesi di un amminoacido? prendo il

ceppo white type, per aumentare la frequenza di mutazione lo tratto con un agente mutageno poi diluisco

e semino su un terreno massimo,

dove cresceranno sia i mutanti

incapaci di sintetizzare la leucina

sia il ceppo white type o anche

altri mutanti che non sono mutati

nella via biosintetica della leucina

ma in altre vie biosintetiche. Tra

tutte le colonie che sono cresciute

in un terreno massimo come

faccio a identificare quella incapace di sintetizzare la leucina? Preparo altre due tipologie di terreni, uno è

un terreno minimo e uno è un terreno minimo al quale aggiungo dall'esterno la leucina. Poi comincio a

trasferire tutte le colonie che ho avuto su un terreno massimo sia sul terreno minimo con la leucina sia su

quello senza la leucina. Incubo e osservo che sul terreno minimo più la leucina cresceranno tutte le colonie,

ma sul terreno minimo senza leucina posso osservare la mancata crescita della colonia corrispondente, in

questo modo riesco a isolare il mutante incapace di sintetizzare quel determinato amminoacido.

Come posso accelerare la procedura? adottando un altro sistema per isolare mutanti auxotrofi che prende

il nome contro selezione con penicillina. All'inizio allestisco una coltura liquida del ceppo white type, poi lo

tratto con l’agente mutageno e dopo averlo trattato con questo agente lo incubo 24 ore in questo terreno

massimo in modo tale che possano crescere sia il ceppo whyte type sia il ceppo auxotrofo. Poi centrifugo in

modo da separare le cellule dal terreno di coltura, butto via il terreno di coltura, sostengo le cellule in

soluzione fisiologica, lo scopo è quello di eliminare tutti i residui di terreno massimo presenti. La

sospensione cellulare poi viene trasferita in un terreno minimo, in cui si moltiplicheranno solo i prototrofi.

A questo terreno aggiungo la penicillina che agisce inibendo la sintesi della parete cellulare, quindi può

agire sul prototrofo che si sta moltiplicando attivamente perché è lì che si sta sintetizzando la parete.

Quindi la penicillina ucciderà le cellule prototrofe ma non quelle auxotrofe. Il passaggio successivo è quello

di eliminare la penicillina e quello poi di seminare su un terreno minimo che contiene una quantità

limitante dell'aminoacido per il quale io voglio isolare il mutante. Osserverò, siccome la concentrazione di

quel determinato amminoacido è limitante, che le colonie sviluppate sono colonie piccole perché

esauriscono in fretta l'amminoacido presente. Se si sviluppassero delle colonie più grandi potrebbero

essere dei prototrofi che sono

sfuggiti dal controllo della

penicillina.

I mutanti sono utili non solo

per capire la funzione di un

gene ma anche per ricostruire

vie biosintetiche, le mutazioni

in generale possono anche

essere soggette al fenomeno di

reversione. Ho un ceppo white

type, ottengo un mutante e

posso ottenere un ceppo che

ha riacquisito le caratteristiche del ceppo white type perché nel mutante è subentrata una reversione.

Questo fenomeno è stato utilizzato a partire dal 1970 per la messa a punto del test di ames, che viene

utilizzato quando si va a verificare se una certa sostanz