Lezione 2 di Analisi farmaceutica 3

POLAR SORBENT TYPE

Si utilizza silice derivatizzata con gruppi ciano, diolici, più polari, e amminici, non utilizzabili con

molecole con gruppi carbonilici in quanto formerebbe legami covalenti con formazione di base di

Schiff.

Vengono utilizzati per lavorare in fase diretta, in modo da estrarre analiti polari da matrici non polari.

Durante il loading si instaurano legami non covalenti dipolo-dipolo o legami ad H tra sorbent e

analita-interferenti. La loading è facilitata in solventi non polari.

Durante l’eluizione per andare a indebolire i legami e favorire l’eluizione, si utilizzano solventi con

caratteristiche polari, come THF, acetonitrile, etilacetato, metanolo, isopropanolo o miscele di

questi.

ANION/CATION SORBENT TYPE

In questo caso si utilizza silice derivatizzata con ammine o acidi in base a se si voglia ottenere un

materiale a scambio ionico o cationico.

Questi materiali servono per analiti con gruppi chimici caricabili.

Durante il loading si svilupperanno legami deboli, principalmente forze elettrostatiche. L’eluizione,

invece, può essere realizzata con un tampone ad elevata forza ionica o mediante alterazione del pH.

Altri sorbenti

Si tratta di materiali più nuovi.

MIXED MODE

Si tratta di materiali a base silicea che portano derivatizzazione di gruppi diversi sulla stessa cartuccia,

ci possono essere catene derivatizzate con caratteristiche apolari e catene per scambio ionico.

Questo permette una maggiore selettività del materiale in quanto aumenta il numero di possibili

legami che si possono instaurare. Un materiale di questo tipo viene scelto per molecole che hanno

caratteristiche per legarsi ai gruppi chimici con cui è stata derivatizzata la silice.

I più comune hanno una combinazione di:

 Un gruppo funzionale idrofobico con lunghezza della catena variabile, le catene più corte

sono le meno ritentive

 Un gruppo funzionale ion-exchange può essere a scambio ionico, cationico o entrambi.

RESTRICTED ACCESS MATERIAL

I restricted access material sono utili per eliminare le proteine in un modo più selettivo.

Si tratta di una tecnica più selettiva della precipitazione, in quanto evita la perdita di analita, la

soppressione ionica nella rivelazione a spettrometria di massa data, molto spesso, dalle proteine

plasmatiche ed è più selettiva.

Anche questi sorbents sono a base silicea ed esercitano due meccanismi principali:

 Ad esclusione molecolare con il quale escludono le proteine grazie alla loro porosità che

permette di escludere le proteine dall’interazione

 Sulla stessa superficie silicea hanno funzionalità apolari che trattengono in fase di loading

l’analita di interesse. Si avrà, quindi, ritenzione selettiva degli analiti di interesse attraverso

meccanismi di partizione grazie a interazioni tipiche di fase inversa, scambio ionico o

adsorbimento.

IMMUNOAFFINITY SORBENTS

I sorbents sono costituiti da una base silicea sul quale sono immobilizzati anticorpi biologici, legati

covalentemente. Oltre alla base silicea è possibile anche utilizzare una base polimerica, di agarosio

o poliacrilamide ad esempio.

L’interazione antigene-anticorpo durante il loading sarà un’interazione ad elevata affinità e

selettività.

Questi sorbents presentano diversi svantaggi:

 Gli anticorpi possono dare cross reactivity, reattività crociata, con analoghi strutturali

 Delicatezza del materiale biologico: i sorbents possono essere denaturati a contatto con

solventi organici o batterici, soprattutto se vengono conservati in modo improprio. Devono

essere utilizzati, quindi, in condizioni non drastiche in termini di solventi organici e pH.

MOLECULARLY IMPRINTED POLYMERS

I molecularly imprinted polymers vengono utilizzati per superare le limitazioni degli immunoaffinity

sorbents. Sono anche chiamati imitatori degli anticorpi fatti dall’uomo.

Si tratta di materiali polimerici artificiali sintetizzati a partire da monomeri funzionali disposti intorno

ad un templato molecolare/molecola stampo in un solvente appropriato. Vengono sintetizzati

artificialmente in modo da essere specifici per una molecola di interesse che si vuole estrarre dalla

matrice complessa.

Per sintetizzarli:

1. Si prepara una miscela di preparazione con i monomeri funzionali, il templato, cioè la

molecola di interesse, un agente cross-linkante e un iniziatore radicalico in un opportuno

solvente porogeno.

2. Si costruisce intorno alla molecola un polimero formando legami non covalenti tra il polimero

e la molecola. Si ottiene, così, una struttura polimerica rigida intorno al templato.

3. Si estrae la molecola, avendo formato legami non covalenti, e si ottiene un materiale

polimerico che possiede cavità complementari per forma, dimensioni e funzionalità

chimiche, all’analita che si vuole estrarre dalla matrice complessa.

I sorbents riconosceranno in una matrice complessa solo la molecola per la quale il polimero è stato

sintetizzato, permettendo quindi un riconoscimento altamente specifico.

C’è un’interazione del tipo antigene-anticorpo ma si tratta di un materiale più robusto, non essendo

biologico, di conseguenza resiste anche a condizioni estreme, cosa che non era possibile con gli

immunoaffinity sorbents.

AUTOMAZIONE

Tutte le operazioni devono essere automatizzate a diversi livelli in modo da aumentare il cosiddetto

troughput. Con troughput si intende la possibilità di eseguire estrazioni in contemporanea per

velocizzare la preparazione di molti campioni.

ESTRAZIONE IN FASE SOLIDA ACCOPPIATA ONLINE ALL’ANALISI CROMATOGRAFIA

La online SPE–LC consente di automatizzare la preparazione del campione in modo molto efficace e

consiste in due procedure integrate: l’estrazione in fase solida online con la tecnica analitica

mediante cromatografia.

L'approccio più comune è il cosiddetto offline: si prepara il campione e poi, dall'eluato, si prende la

provetta e la si analizza con un cromatografo.

Questa tecnica prevede l’utilizzo di cartucce simili alle lastrine per la cromatografia.

La procedura online ha diversi passaggi:

1. Si prepara il campione su una cartucca SPE: viene montata sullo strumento in modo che il

passaggio finale di eluizione permetta all'analita di passare direttamente nella colonna: nella

maggior parte dei casi, questo si realizza connettendo la cartuccia dove normalmente si trova

il loop della valvola di iniezione.

2. La fase di loading e la fase di washing devono essere effettuate quando la cartuccia sarà

staccata dalla colonna cromatografica. Questo in quanto nel loading l’obiettivo è trattenere

all’interno della cartuccia mentre nel washing l’obiettivo eliminare gli interferenti.

3. Quando la cartuccia viene connessa al sistema, avviene l’eluizione

SPE online comporta un guadagno di tempo, per questo è automatizzata. Sicuramente, però, la sua

preparazione è piuttosto complessa.

Diverse apparecchiature possono essere utilizzate in modalità automatizzata, come:

 Online SPE-LC

 Multichannel pipettors: le versioni più comuni si accomodano 4 o 8 canali che pipettano

simultaneamente. Vengono utilizzati per la diluizione e ogni passaggio che richiede

pipettamento.

 Stazioni di evaporazione: eseguono un’evaporazione simultanea di campioni estratti.

Possono essere utilizzate nel passaggio di evaporazione della LLE e nella SPE

 Centrifughe: le centrifughe a 96 well plate possono dare accesso ad un high throughput.

Vengono utilizzati principalmente nel pretrattamento.

 96 well pipettors

 Vacuum manifolds: può presentare molte postazioni. Nel piano inferiore si trovano le

provette di raccolta, mentre nel piano superiore si trovano i sorbents adattati alla camera

sottovuoto.

 Multi-function workstations: possono essere semi-automatizzate o completamente

automatizzate, si tratta di strumenti/camere completamente robotizzate che si possono

trovare nelle industrie farmaceutiche. Vengono utilizzati per pipettare, trasfeerire liquidi, fare

il vuoto, applicare una pressione positiva, evaporare e iniettare direttamente nella

strumentazione analitica.

 Dedicated platforms for automation

SVILUPPO DEL METODO

Lo sviluppo del metodo prevede l’ottimizzazione delle condizioni per eseguire un protocollo in SPE.

Per lo sviluppo del metodo ci sono diversi fattori da prendere in considerazione: la natura chimico-

fisica del campione, della matrice e dei contaminati, la competenza e la strumentazione disponibile,

il numero di campioni da processare e il grado di purificazione richiesto.

CONVALIDA DEL METODO

Quando bisogna mettere a punto un metodo di estrazione, bisogna sempre studiare prima di

operare. Bisogna pensare a quanto semplice dev’essere la preparazione del campione (ad es.

estrazione liquido-liquido è più facile di estrazione in fase solida), bisogna pensare il numero di

campioni, il loro volume, di che selettività abbiamo bisogno ( ad es. analita a bassa concentrazione

in fase mobile ad elevata concentrazione).

IMPACCAMENTI COLONNE CROMATOGRAFICHE

Per selezionare la colonna adatta allo scopo dell’analisi da eseguire in un laboratorio di ricerca, come

in una ditta farmaceutica, un analista si trova a consultare cataloghi davvero molto corposi.

Il numero di produttori specializzati è in continuo aumento, come il numero dei prodotti e di colonne

HPLC: spesso, per decidere la colonna adatta allo scopo dell’analisi, ci si basa sull’analogia con

applicazioni simili già pubblicate, oppure si scelgono le fasi più comuni in commercio.

Gli scopi di un’analisi possono essere molteplici:

 Identificazione e/o quantificazione di un principio attivo in una forma farmaceutica o in un

campione biologico

 Separazione del principio attivo dalle sue impurezze

 Valutazione della stabilità di un principio attivo e la separazione dei suoi prodotti di

degradazione

 Studi di farmacocinetica

 Controllo di intermedi di reazione in un laboratorio di analisi

 Tipo di analita e i relativi parametri chimico-fisici

 Scelta del tipo di cromatografia

 Meccanismo di interazione

 Fase stazionaria

Lo scopo più importante dell’analisi è sempre quello di ottenere un’elevata efficienza, che a sua volta

influenza la risoluzione, la sensibilità, la selettività e i tempi di analisi.

È sempre necessario, infatti, cercare di ottenere tempi di analisi brevi e un ridotto consumo del

solvente, tenendo conto del consumo, tossicità e smaltimento.

IL SUPPORTO: LA SILICE

Il gel di silice è il materiale adsorbente più utilizzato in cromatografia liquida come supporto per la

fase stazionaria.

In HPLC la silice può essere impiegata in:

 Forma dir