Lezione 1 di Analisi farmaceutica 3

SAMPLE PREPARATION TECHNIQUES

Le tecniche di preparazione del campione sono diverse. Nel nostro caso prenderemo in

considerazione:

 L’estrazione liquido-liquido

 L’estrazione in fase solida

 L’estrazione in fase supercritica

Approcci di estrazione per la preparazione del campione

L’estrazione coinvolge il trasferimento dell’analita target o del campione di contaminanti

indesiderato da una fase chimica ad un’altra.

È necessario avere, quindi, almeno due fasi. Una fase chimica può essere un liquido, un solido o un

gas.

La maggior parte dei metodi di preparazione sfruttano:

 Due liquidi nel caso dell’estrazione liquido-liquido, LLE

 Un liquido e un solido come nel caso dell’estrazione in fase solida, SPE

Si dice che il trasferimento è quantitativo quando tutte le molecole dell’analita di interesse si

trasferiscono nell’altra fase, avviene una vera e propria purificazione. In alcuni casi, infatti, si

possono ottenere campioni molto puri.

La matrice in un campione complesso è tutto ciò che non è l’analita di interesse.

Selettività: più è efficace la procedura a separare l’analita di interesse dai contaminanti indesiderati,

più è selettiva. Si isola in una delle due fasi l’analita di interesse e nell’altra il contaminante

indesiderato.

È possibile permettersi di non esagerare con l’isolamento quantitativo perché a valle ci sarà sempre

una tecnica separativa.

ESTRAZIONE LIQUIDO-LIQUIDO

Il principio di estrazione di questo metodo è sfruttare la solubilità differente dei vari componenti del

campione complesso in solventi differenti. La maggior parte dei campioni farmaceutici sono acquosi

e le molecole dei farmaci sono piuttosto apolari, quindi, vengono usati generalmente solventi

estraenti organici e non polari.

Per eseguire l’estrazione liquido-liquido viene utilizzato l’imbuto separatore.

1. Si versano nell’imbuto separatore il campione e un solvente immiscibile con il solvente in cui

si trova l’analita di interesse in modo da formarsi due strati separati, formazione di un

sistema bifasico.

2. Dopo aver chiuso il tappo in alto dell’imbuto si agita in modo che le due fasi vengano a

contatto.

3. Si lascia riposare in modo che le due fasi si separino nuovamente. Avverrà la ripartizione

selettiva dell’analita rispetto ai contaminanti

4. Raccolta della fase estraente liquida contenente l’analita di interesse. È possibile andando a:

o Spipettare quando la fase da estrarre è quella superiore dell’imbuto

o Aprire il rubinetto quando la fase da estrarre è quella inferiore

o Lavorare sul diverso punto di congelamento dei due solventi: si va a congelare la fase

acquosa e versare la fase organica.

Isolando la fase liquida contenente l’analita target, avremo quindi una provetta contenente

l’analita di interesse in un solvente che dovrà essere compatibile con la fase mobile che verrà

utilizzata in seguito.

5. Si porta a secco il contenuto della provetta in modo da concentrare il campione e, se

necessario, da sostituire il solvente con uno compatibile con la fase mobile. È possibile

portare a secco con rota vapor oppure insufflando azoto, lo scopo è ridurre il volume.

6. Dopo aver portato a secco si va a ricostituire il campione, concentrarlo, con un volume più

piccolo di solvente compatibile con la fase mobile. Ovviamente, anche questo nuovo solvente

dovrà permette all’analita target di restare in soluzione.

Quello che succede a seguito dell’agitazione dipende da vari parametri come dalla natura chimica

dei due solventi utilizzati e dai volumi dei due solventi.

Il risultato dovrebbe essere una partizione selettiva dell’analita rispetto ai contaminanti.

Il solvente estraente estrae l’analita di interesse e potenzialmente altri analiti. Ma è possibile anche

fare l’inverso, cioè estrarre tutto ciò che non è di interesse e mantenere nel campione soltanto

l’analita.

Queste operazioni sono preliminari all’analisi cromatografica. La preparazione del campione è a

servizio dell’analisi, la quale richiede un protocollo di operazioni antecedenti in modo da riuscire a

utilizzare in HPLC il campione.

Per decidere quali solventi è meglio utilizzare, che siano immiscibili tra loro, si ricorre alla tabella di

miscibilità dei solventi. Questa tabella permette di trovare la compatibilità di un campione con la

fase mobile utilizzata nella cromatografia.

Spesso i campioni si possono trovare in un ambiente polare, come il plasma. Si scelgono come

solventi estraenti solventi organici come diclorometano e l’esano, immiscibili in acqua.

La selettività è un termine che si applica al protocollo. Il protocollo è selettivo quando è in grado di

distinguere l’analita di interesse dagli analiti non di interesse del campione. Un'estrazione meno

selettiva rimuove solo una piccola quantità di contaminanti, mentre un'estrazione più selettiva

rimuoverà una porzione maggiore di contaminanti, isolando, così, nella fase estraente l'analita

altamente purificato, come si vede nelle immagini riportate.

Il coefficiente di partizione è un rapporto che esprime il grado a cui un analita, una molecola, si

ripartisce più favorevolmente in una fase piuttosto che un’altra.

Il coefficiente di partizione, K , è la concentrazione dell’analita nella fase estraente sulla

d

concentrazione dell’analita nella fase 1, cioè la fase in cui si trova a inizio analisi.

Il coefficiente di partizione dipende dal tipo di solvente estraente e dalla purezza del solvente stesso:

utilizzando come solvente estraente il dietiletere, ad esempio, avere la sua purezza certificata è

molto importante per riuscire a riprodurre il protocollo.

La purezza è importante perché il solvente estrae in virtù delle sue caratteristiche: anche piccole

percentuali di impurezze di solventi possono variare l’efficienza.

Anche il volume del solvente e il valore di pH sono molto importanti; il valore di pH, in particolare, è

molto importante se una delle due fasi è acquosa.

Il valore di pH di una fase acquosa è molto importante in quanto governa il grado di dissociazione di

un analita in base alla sua pKa. Se l’analita è più o meno dissociato sarà più o meno polare, quindi,

si dissocerà più o meno facilmente in una fase piuttosto che nell’altra.

I vantaggi dell’estrazione liquido-liquido sono:

 Tecnica semplice

 Sviluppo del metodo semplice, cioè mettere a punto il protocollo prendendo delle decisioni

in modo facile

 Poco costoso

Gli svantaggi sono:

 Limitata selettività in quanto affida il meccanismo di separazione, la selettività, alla quantità

di solventi che abbiamo a disposizione. I solventi devono essere immiscibili tra lroo quindi la

scelta è limitata

 L’esecuzione è abbastanza lunga

 La purezza del campione è limitante

 La formazione di emulsioni nel caso in cui abbiamo fosfolipidi

 Uso di solventi organici, tra cui i clorurati che sono tossici

ESTRAZIONE IN FASE SOLIDA

L’estrazione in fase solida ha due fasi: una liquida e una solida.

A confronto del limitato numero di solventi estraenti da impiegare in liquid-liquid extraction, il

grandissimo numero dei materiali di impaccamento a disposizione, la diversità della chimica di questi

materiali e la loro tecnologia, sempre più innovativa, rendono la SPE una tecnica versatile, flessibile

e maggiormente selettiva rispetto alla LLE.

A livello temporale, la SPE è stata sviluppata dopo la LLE per risolvere le seguenti limitazioni:

 Selettività

 Flessibilità

 Versatilità

 Facilità di automazione

SPE è un processo separativo attraverso il quale composti sciolti in una miscela liquida sono separati

da altri composti secondo le loro caratteristiche fisiche e chimiche. In pratica, è governata da processi

cromatografici.

In SPE il campione è in una miscela liquida. Questa miscela viene introdotta in una cartuccia,

cartridge, contenente un materiale di impaccamento a base di silice o a base polimerica e viene

chiamato packing sorbent.

Analogamente alla cromatografia, un solvente fluisce attraverso il packing bed.

A differenza della cromatografia, dove la colonna cromatografia è di acciaio inossidabile ad elevate

pressioni e la fase mobile fluisce tutto il tempo all’interno, in SPE il processo si realizza step by step,

a passaggi. La ritenzione, o la eluizione selettiva dei componenti del campione, è guidata dalla

composizione della fase solida e dalla composizione che fluisce attraverso il packing bed.

Il materiale di impaccamento è anche noto come colonna. La SPE è un processo a 5 passaggi:

1. Condizionamento

2. Equilibrazione

3. Caricamento

4. Lavaggio

5. Eluizione

Tutti questi passaggi dipendono dalla chimica del sorbente e dalla chimica del solvente utilizzato per

tutti i passaggi.

- COLUMN CONDITIONING

Il materiale di impaccamento è apolare, a base silicea.

Dopo aver introdotto in colonna una miscela liquida contenente un letto di materiale di

impaccamento a base di silice/polimerico, packing sorbent, si attiva, o umetta, il solvente

cromatografico per permettere un'adeguata interfaccia della fase solida con il campione da applicare

per instaurare legami covalenti non idrofobici.

Molti extraction solvents sono estremamente idrofobici, quindi richiedono questo passaggio

preventivo di condizionamento, perché, diversamente, non si umetterebbero all'applicazione di un

campione acquoso.

Si fa passare attraverso la cartuccia un solvente che sia miscibile con l’acqua, in quanto spesso i

campioni sono acquosi, solitamente acetonitrile o metanolo.

- COLUMN EQUILIBRATION

È necessario equilibrare la colonna prima dell’applicazione del campione.

La sua funzione è quella di creare un ambiente chimico attorno al solvente il più possibile simile a

quello del campione, così da impedire che la chimica del campione modifichi l'ambiente di

estrazione durante l'applicazione del campione stesso.

L’equilibrazione del sorbent è fondamentale, altrimenti i risultati sono irriproducibili e il recupero

dell'analita, recovery, è basso. Se questo passaggio non viene eseguito correttamente, spesso le

recoveries saranno basse.

l pH è un parametro particolarmente importante per l'efficacia della chimica di estrazione, in

particolare quando lo stato di carica del campione è rilevante per il meccanism