Relazione Laboratorio di Microbiologia

Curva di crescita batterica

In microbiologia generale si studia la crescita di una popolazione piuttosto che delle singole cellule, detto ciò, si può osservare come questo andamento sia stato categorizzato in una curva di crescita che è rappresentata da:

• Cinetica osservata quando i microrganismi sono coltivati in terreno liquido (brodo di coltura) in un sistema chiuso (batch)
• Misura la variazione di "quantità" (massa totale o numero di cellule vitali) di batteri nel tempo
• Rappresentazione grafica di tipo "semilogaritmico"
• log10 (CFU/ml) vs tempo

Le fasi principali della curva di crescita sono date da:

• Fase lag o fase di latenza
• Fase log o fase logaritmica
• Fase stazionaria o plateau
• Fase di declino o morte

Fase di latenza: nella fase lag non c'è un aumento del numero di cellule. Si tratta infatti di una "fase di adattamento" dove si potrebbe eventualmente...

Apprezzare un lieve aumento volumetrico cellulare. In questo periodo, più o meno breve a seconda delle condizioni e talvolta anche assente, solitamente si osserva sintesi di nuovi enzimi e nuove componenti strutturali cellulari;

• Fase esponenziale: nella fase log i microrganismi crescono e si dividono alla massima velocità possibile relativamente al loro potenziale genetico, alle condizioni di crescita e alla natura del terreno in cui sono stati inseriti;
• Fase stazionaria: plateau il numero totale di cellule vitali rimane costante. Sono diversi i motivi per cui si arriva a questa fase, primo tra tutti l'esaurimento dei nutrienti (e di ossigeno libero se si fa riferimento alle specie aerobie) presenti nel terreno. Inoltre, potrebbe avvenire un accumulo di cataboliti giungendo, infine, ad un'elevata densità cellulare;
• Fase di declino: a volte definita anche come fase di morte, è caratterizzata da una diminuzione del numero di cellule vive.

nel tempo. Durante questo periodo, si verifica lisicellulare e perdita irreversibile della capacità di riprodursi;

Modello matematico per valutare la crescita batterica

Riuscire ad ottenere una modellazione della crescita microbica è un obbiettivo importante della microbiologia predittiva. In particolar modo, per prevedere l'andamento della crescita batterica è molto utile far riferimento a quelli che vengono definiti modelli matematici primari.

Le diverse fasi della curva di crescita di una popolazione batterica possono essere descritte dall'equazione:

dove N rappresenta la popolazione, mentre le costanti r e K rispettivamente il tasso di crescita e il termine asintotico della popolazione (definito dalle risorse disponibili nell'ambiente).

Tecniche per misurare la crescita batterica

Esistono molti metodi per misurare la proliferazione batterica. Le tecniche più comuni sono: la conta totale (mediante microscopio), la conta vitale (mediante

piastramenti) o la stima della massa cellulare con, ad esempio, la misurazione turbidimetrica. Ciò che permette di effettuare misure di torbidità è l'uso dello spettrofotometro: tanto maggiore è il numero delle cellule presenti, tanto più densa (opaca) sarà la coltura, riflettendo così la luce.

Uso dello spettrofotometro per la misurazione della torbidità batterica.

MIC - Minima concentrazione inibente

La MIC indica la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di inibire in vitro la crescita batterica. Costituisce uno strumento di grandissima utilità sia per il microbiologo che per il clinico il quale viene coadiuvato nella scelta della migliore strategia terapeutica, soprattutto in caso di particolari criticità relative, ad esempio, alla sede d'infezione in determinati distretti organici, alle condizioni cliniche del paziente, alla presenza di microrganismi multiresistenti ecc.

Per interpretare la MIC

in modo corretto occorre anzitutto considerare che:

1. valori preceduti da segno ≤ indicano che la crescita del microrganismo è stata inibita dalla più bassa concentrazione dell'antibiotico testato esprimendo, quindi, una notevole sensibilità:

   Esempio AMIC antibiotico X ≤ 8 - MIC antibiotico Y ≤ 0,5

   Il microrganismo si è dimostrato tanto sensibile a X quanto a Y.

2. se non preceduto da tale segno, il valore della MIC dovrebbe essere valutato anche in relazione alla "distanza" dal valore del breakpoint (valore soglia) fra la categoria S e quella I o R (limite di sensibilità).

   Esempio BMIC antibiotico X = 1 con breakpoint = 8 - MIC antibiotico Y = 1 con breakpoint = 2

   X è l'antibiotico con la MIC più favorevole.

Per interpretare la MIC e scegliere il principio attivo più efficace:

• Tanto più la MIC sarà vicina al valore soglia tanto più vi sarà rischio di fallimento terapeutico.

Se

Il valore di MIC è ≥ allora si ha la massima resistenza per quel principio attivo.

A parità di sensibilità/MIC, scegliere sempre le molecole efficaci più semplici in modo da non sollecitare i meccanismi di resistenza batterici verso le molecole più nuove.

A parità di sensibilità, più basso è il valore di MIC e più sensibile è la molecola.

Scrivere il protocollo della curva di crescita di Labster spiegando il significato dei passaggi salienti:

1. Allo spettrofotometro hai letto un OD 600 pari a 0,350. Considerando la diluizione che hai eseguito direttamente in cuvetta (100 μL di coltura cresciuta ON e 900 μL di terreno LB fresco), qual è l'OD reale della coltura?

Applico la nota formula: C1*V1 = C2*V2

0,350*100 = X*900

X = 35/900

X = 0,38

OD = 0,38