Esercitazioni laboratorio microbiologia 2

DETERMINAZIONE DI ST. AUREUS

Si prelevano 10 g circa di prodotto (ad es. campione di carne) e si inseriscono nel sacchetto Stomacher.

Si aggiunge una soluzione di in quantità tale da eseguire la prima diluizione decimale.

SALE TRIPTONE

Si omogeneizza il tutto e si eseguono le successive diluizioni.

A questo punto si esegue la semina per spatolamento di 0,1 mL della diluizione precedente a quella da

eseguire, su piastre di . Questo terreno contiene:

TERRENO BP (BAIRD PARKER)

- Lecitina (rosso d’uovo) —> perchè il 60% degli St. sono lecitinasi positivi (è inoltre tossica per gli altri

microrganismi)

- Coagulasi —> perchè il 90% degli St. sono coagulasi positivi

Si procede all’incubazione in termostato a 37°C per 48h.

Al termine si fa una valutazione e un conteggio delle colonie tipiche o sospette.

Prove di conferma:

- Test della coagulasi —> Da ciascuna piastra si isolano le colonie tipiche o sospette su terreno BHI e si

procede a incubazione a 37°C per 24 h.

Si miscelano poi 0,1 ml di sospensione batterica con 0,3 ml di plasma di coniglio. Incubare ancora a 37°C. Si

verifica infine la formazione del coagulo.

DETERMINAZIONE DI LISTERIA MONOCYTOGENES

La legge richiede assenza di L. Monocytogenes in 25 g di prodotto.

Si prelevano 25 g circa di prodotto (ad es. campione di frutta o ortaggio) e si inseriscono nel sacchetto

Stomacher.

Si aggiungono 225 ml di addizionato degli idonei

BRODO DI ARRICCHIMENTO PRIMARIO (HALF FRASER)

supplementi (ANTIBIOTICI).

Si omogeneizza il tutto.

A questo punto bisogna incubare la sospensione a 30°C per 24 h in modo da favorire la crescita delle cellule

di Listeria eventualmente presenti.

Si prelevano 0,1 ml di sospensione e si inoculano in 10 ml di brodo di arricchimento secondario Fraser

addizionato degli idonei supplementi (antibiotici).

Incubazione della sospensione a 37°C per 48 h.

Se è cresciuta Listeria vi sarà un viraggio e la provetta risulterà nera.

In quel caso si preleva una aliquota di sospensione con l’ansa e si striscia su piastre di TERRENO PALCAM E

ALOA.

Incubare a 37°C per altre 24-48 h e infine verificare la presenza o assenza di colonie sospette o tipiche sul

terreno selettivo. L’analisi di listeria non prevede una conta, non è quantitativa bensì qualitativa.

Prove di conferma:

- Osservazione microscopica mobilità —> si osserva il movimento tipico di questo microrganismo

- Colorazione di gram

- Catalasi

- Emolisi

DETERMINAZIONE DI SALMONELLA

Si prelevano 25 g circa di prodotto e si inseriscono nel sacchetto Stomacher.

Si aggiunge una soluzione di 225 ml di (è un arricchente di nutrienti).

ACQUA PEPTONATA TAMPONATA

Si procede a incubare la miscela a 37°C per 24 h in modo da favorire la crescita delle cellule di Salmonella

eventualmente presenti.

Si inoculano 10 ml di brodo di MgCl2 al verde malachite con 0,1 ml di prearricchimento.

Incubazione a 42°C per 24 h.

SI preleva una aliquota di miscela con l’ansa e si striscia su piastra di e su piastra di

TERRENO BGA

. Generalmente in questi terreni c’è del lattosio, utile a capire se ci sono altre

TERRENO SSA

Enterobacteriaceae. Salmonella infatti non è in grafo di usare il lattosio mentre le altre enterobacteriaceae

sono in grado di fermentarlo.

Incubare entrambe le piastre a 37°C per 24h e infine verificare la presenza di colonie tipiche o sospette sui

terreni selettivi incubati. Se si riscontra attraverso il viraggio che potrebbe esserci Salmonella, seguono

molte altre prove morfologiche e fisiologiche per capire se effettivamente è Salmonella e nel caso di che

specie si tratta.

Prove di conferma:

- Osservazione microscopica

- Colorazione di gram