Genetica - parte 2

Regolazione dell'espressione genica nei procarioti

Perché si studia la regolazione dell'espressione genica? I geni di un organismo non sono mai espressi tutti contemporaneamente, ma l'espressione di questi geni è regolata. Se consideriamo cellule di tessuti diversi, le cellule sono diverse a livello fenotipico, il che dipende dalle proteine che sono presenti, che dipendono a loro volta da quali geni sono espressi. I geni rispondono anche alle condizioni ambientali.

Nei microrganismi l'ambiente, cioè i fattori che influenzano l'espressione genica, può essere il terreno di coltura o il suolo. In particolare l'ambiente sono i nutrienti presenti: possono prelevare i composti dall'ambiente esterno o sintetizzarli. La logica è quindi quella di minimizzare i consumi energetici: attivano vie metaboliche solo per quei composti che sono presenti nell'ambiente.

I geni possono essere:

• Costitutivi o housekeeping

Sono quei geni che sono sempre attivi all'interno delle cellule. Sono i geni che sono essenziali per la cellula, ad esempio rRNA, tRNA, proteine ribosomali, subunità della DNA e RNA polimerasi.

Regolati → sono richiesti in particolari condizioni ambientali.

• geni delle vie cataboliche, sono attivati dal substrato
• geni delle vie metaboliche (anaboliche), sono repressi dal prodotto se questo è già presente nell'ambiente

Il modello dell'operone lac

Le prime osservazioni furono a livello degli enzimi: nelle cellule batteriche la presenza di alcuni enzimi era diversa a seconda del terreno. Ad esempio la β-Galattosidasi, che è un enzima che serve per il metabolismo dellattosio, nei batteri su terreni con lattosio presente questo enzima veniva sintetizzato, su un terreno senza lattosio invece la β-Galattosidasi non compare. Questo porta a pensare che l'espressione dei geni per la β-Galattosidasi fosse stimolata dalla

presenza del lattosio. Per la triptofano-sintetasi se il triptofano è presente l'enzima non viene prodotto, in mancanza di triptofano igeni si attivano e producono la triptofano-sintetasi. Si arrivò a produrre due modelli di regolazione:

• Operone lac → inducibile. La presenza del lattosio induce la trascrizione dei geni coinvolti nel metabolismo.
• Operone trp → reprimibile. La presenza del triptofano reprime la trascrizione.

La regolazione di questi geni avviene a livello della trascrizione. Questo è però solo uno schema: la trascrizione dei geni del lattosio (e in generale di molti geni) è il risultato di due forze, una che reprime e l'altra che attiva. Un operone è una struttura tipica dei microrganismi. Un operone è un gruppo di geni che hanno un promotore in comune. Quindi i geni di un operone vengono trascritti insieme.

Gli enzimi del metabolismo del lattosio:

• Permeasi → trasporta il lattosio

• β-Galattosidasi → una volta dentro la cellula, il lattosio viene modificato da due enzimi tra cui la β-Galattosidasi. Scinde lattosio in galattosio e glucosio e compie l'isomerizzazione del lattosio in allolattosio.
• Transacetilasi (funzione poco chiara) → trasferimento di un gruppo acetilico da acetilCoA.

1. mutagenesi su E. coli e isolamento dei mutanti
2. mappatura
3. studio funzionale

• Geni strutturali → ilfenotipo consiste nell'assenza di una specifica attività enzimatica. Ipotizzano che siano mutanti per quei geni di cui mancano l'attività. Li chiamano mutanti strutturali (geni strutturali hanno un'azione specifica). ● Geni regolatori → riguardano tutti gli enzimi, sono mutanti dei geni regolatori (un gene influenza altri tre geni). Il fenotipo può quindi essere: enzimi sono prodotti in modo costitutivo o enzimi non sono mai prodotti. → Geni strutturali: lacZ, lacY, lacA → Geni regolatori: lacI e le due regioni di regolazione operatore e promotore I geni del metabolismo del lattosio sul genoma di E. coli sono tutti nella stessa regione. Sull'operone lac sono presenti i 3 geni strutturali lacZ (β-galattosidasi), lacY (permeasi), lacA (transacetilasi). A monte c'è la regione operatore detta lacO. Prima ancora c'è il gene lacI, che è composto da una sequenza codificante, il promotore e la

  terminazione. L'operone produce un messaggero policistronico, cioè che contiene molte unità funzionali, in particolare 3, lacZ, lacY e lacA. Nei procarioti trascrizione e traduzione sono accoppiati.

  Per capire il funzionamento si considerano due casi: in presenza e in assenza di lattosio.

  Assenza: se non c'è lattosio non servono gli enzimi, quindi l'operone è soggetto a repressione che è operata dalla proteina prodotta dal gene lacI. Il gene lacI regolatore, produce la proteina repressore che è composta da due domini: un dominio si lega all'operatore, che si trova a valle del promotore quindi la polimerasi si lega al promotore ma non può scorrere. Quindi in assenza di lattosio la trascrizione è bloccata e manca il trascritto.

  Presenza: in questo caso il lattosio è presente, ed è l'unica fonte di carbonio. Il lattosio, in particolare il suo isomero l'allolattosio, si lega al secondo dominio della

  proteina repressore (che viene sempre prodotta), il che causa un cambiamento conformazionale della proteina stessa. Il repressore viene quindi inattivato, non può più legarsi all'operatore, quindi la polimerasi può scorrere portando avanti la trascrizione. Il trascritto viene prodotto.

  L'allolattosio viene prodotto dalle β-galattosidasi che rimane nella cellula anche se l'operone lac non è (ancora) attivato.

  Mutanti nei geni che codificano i tre enzimi

  Trovarono due tipi di mutanti:

  • Per sostituzione di base:
    • Z- Y+ A+
    • No β gal
    • Sì permeasi
    • Sì transacetilasi
    • - Z+ Y- A+
    • Sì β gal
    • No permeasi
    • Sì transacetilasi
    • - Z+ Y+ A-
    • Sì β gal
    • Sì permeasi
    • No transacetilasi
  • Nonsenso - c'è un codone di stop. Se il ribosoma si stacca su Z si ripercuote anche su A e Y, un distacco amonte si ripercuote anche a valle:
    • Z- Y+ A+
  No β gal○ No permeasi○ No transacetilasi● – Z+ Y- A+○ Sì β gal○ No permeasi○ No transacetilasi● – Z+ Y+ A-○ Sì β gal○ Sì permeasi○ No transacetilasi Questo effetto sui mutanti nonsenso viene definito effetto polare. Se il ribosoma si stacca a monte, nulla gli impedisce di riattaccarsi più a valle, ma non lo fa perché il trascritto libero assume dei ripiegamenti che determinano anche loro l'arresto della traduzione. Mutanti nei geni regolatori: - Mutazione lacI → produce un repressore difettoso che ha il dominio di legame con lacO difettoso. Si ha quindi un repressore che non reprime. Sia in presenza che in assenza di lattosio il repressore non si lega all'operatore e la sequenza viene sempre trascritta → sintesi costitutiva. - Mutazione lacO → è alterata la sequenza di lacO che non riesce a legarsi al repressore (le proteine repressore hanno specificità nel target e se non lo

  riconosce più non si lega) → sintesicostitutiva.

  Analisi della relazioni di dominanza/recessività

  Per studiare le relazioni di dominanza e recessività servono contemporaneamente due alleli, e per fare ciò sipossono usare i diploidi parziali. Quindi si fa un confronto tra il diploide parziale con il fenotipo wild-type inassenza induttore (no enzimi) o in presenza di induttore (sì enzimi).

  + -Es. sul cromosoma di coli si ha l’allele lacI , mentre sull’altro filamento lacI (sul diploide parziale). Si hanno+contemporaneamente due proteine, una normale e una mutata. Quella normale si lega a lacO che si trova in cis.

  30In assenza di allolattosio la sintesi è repressa si ha il wild type. Se arriva il lattosio, questo sposta il repressore+ -da lacO e anche in questo caso prevale il fenotipo wild type. Conclusioni: recessività della mutazione lacI .

  Es. super repressore (vedi esercitazione)

  Regolazione dell’operone lac

  proteina repressore esercita un controllo di tipo negativo sull'operone, ma successivamente si scoprirà che l'operone lac è sottoposto anche a controllo positivo. Anche questo è un sistema di controllo dell'espressione genica, mediato dal complesso CAP-cAMP. E.coli preferisce il glucosio al lattosio perché entra nella glicolisi senza altre modificazioni. Si attiva la trascrizione dell'operone lac solo in assenza di glucosio o quando ce n'è poco. Vicino al sito della RNA polimerasi c'è anche un sito detto sito CAP, chiamato così in quanto lega la proteina CAP. Questa proteina CAP (catabolite activator protein) stimola la trascrizione, rafforza il legame tra RNA polimerasi, fattore sigma e promotore. La proteina CAP però non sempre è presente: nella cellula è presente la proteina CAP inattiva, che diventa attiva quando si lega al cAMP. Il complesso CAP-cAMP stimola la trascrizione. Il cAMP vienesintetizzato a partire dell'ATP da un enzima detto adenilato ciclasi, il quale a sua volta dipende dalle concentrazioni di glucosio: ● se c'è poco glucosio nella cellula si attiva l'adenilato ciclasi, c'è tanto cAMP, si forma tanto CAP-cAMP che favorisce il legame con il sito CAP che stimola la trascrizione e quindi la cellula usa anche il lattosio. ● se il glucosio c'è, c'è poco di adenilato, poco cAMP, poco CAP-cAMP e non stimola la trascrizione che si blocca. In questo caso si parla di repressione da catabolita. In presenza di glucosio e lattosio, il glucosio viene usato preferenzialmente. Controllo positivo e negativo dell'operone lac - indicare i livelli di trascrizione nelle seguenti situazioni: ● Glucosio scarso o assente, Lattosio presente → mRNA lac abbondante ● Glucosio elevato, Lattosio presente →