Genetica

Regolazione genica nei procarioti

Operone lac in E. coli

Il controllo dell'espressione genica è un processo essenziale in ogni organismo. Tale affermazione è ovvia negli organismi pluricellulari, dove i vari tipi cellulari svolgono funzioni altamente specializzate e sono programmati per esprimere solo alcuni dei propri geni e non altri. Tuttavia, anche i microrganismi hanno bisogno di regolare i propri geni; i batteri, per esempio, hanno una grande versatilità dal punto di vista metabolico e in particolare nell'utilizzazione degli zuccheri come fonte di carbonio. Se la cellula batterica dovesse sintetizzare simultaneamente tutti gli enzimi coinvolti in tali processi, probabilmente consumerebbe più energia di quanto riuscirebbe a ricavarne.

La cellula batterica ha quindi sviluppato dei meccanismi per reprimere tutti i geni che non sono necessari, attivandoli solo nel momento in cui servono. I modelli di controllo dell'espressione genica più conosciuti sono quelli legati alla funzione dell'operone lattosio e dell'operone triptofano. L'operone è un complesso di geni che codifica le proteine necessarie allo svolgimento di una funzione coordinata: ad esempio, la sintesi degli enzimi necessari per l'utilizzazione di un substrato, o la sintesi di enzimi che intervengono nelle vie biosintetiche di piccole molecole come gli aminoacidi.

Un operone è un'unità che coordina e regola la trascrizione nei batteri. Il modello dell'operone è stato proposto da Jacob, Monod, e Wollman sulla base dei loro studi biochimici e genetici delle mutazioni che inducevano la dipendenza di E. coli al lattosio nel 1961.

Un operone è un'unità del cromosoma batterico costituito dai seguenti componenti:

• Promotore
• Operatore
• Geni strutturali propriamente detti, ossia quei geni che codificano per proteine regolatrici o strutturali
• Sequenza termine

Il promotore è la sequenza di DNA dell'operatore riconosciuta dalla RNA polimerasi DNA-dipendente. Il sito di inizio per la sintesi dell'RNA successivo al promotore. Il gene per la RNA polimerasi DNA-dipendente non fa parte dell'operone, per il fatto che l'enzima RNA polimerasi trascrive tutti gli operoni batterici. È la sequenza alla quale si lega l'RNA polimerasi per l'inizio della trascrizione.

L'operatore è la regione di DNA dell'operone dove si lega la proteina regolatrice, con funzione di repressore della trascrizione.

Geni strutturali propriamente detti: l'operone codifica uno o più geni di enzimi inducibili. L'operone lac, a esempio, codifica gli enzimi necessari al metabolismo del lattosio, incluso la β-galattosidasi, la β-galattoside permeasi, e la β-galattoside transacetilasi.

La sequenza termine, costituita da basi di adenina, indica il termine della sequenza.

In presenza di lattosio il microrganismo può utilizzare questo disaccaride come fonte energetica, idrolizzandolo nei due monosaccaridi glucosio e galattosio tramite l'enzima beta-galattosidasi, codificato dai geni dell'operone Lac.

L'operone lac appartiene al tipo di operoni che attivano la trascrizione in risposta alla comparsa di un induttore. In questo sistema la proteina repressore presenta due siti di legame: uno per l'operatore e l'altro per l'induttore. Gli induttori dell'operone lac sono le molecole di allolattosio, un intermedio metabolico dell'idrolisi del lattosio. Il legame con l'induttore modifica stericamente la proteina repressore. In seguito al cambiamento di forma, il repressore non può più legarsi all'operatore; di conseguenza l'RNA polimerasi può legarsi al promotore e dare inizio alla trascrizione dei geni strutturali. L'mRNA trascritto viene poi tradotto a livello dei ribosomi per sintetizzare le tre proteine necessarie al metabolismo del lattosio.

A mano a mano che il lattosio viene metabolizzato, la sua concentrazione si riduce. Quando la concentrazione di lattosio si abbassa, le molecole di induttore si separano dal repressore, che riacquista la sua forma originaria e si lega all'operatore, bloccando la trascrizione dell'operone lac.

Dato che l'mRNA già presente nella cellula si degrada rapidamente, poco dopo cessa anche la traduzione. È dunque la presenza o meno di lattosio (ovvero dell'induttore) a regolare la formazione del legame fra repressore e operatore, e quindi anche la sintesi delle proteine coinvolte nel metabolismo del lattosio. Per questo l'operone lac è un sistema inducibile.

Per riassumere, quando nella cellula è presente lattosio, alcune molecole vengono trasformate in un intermedio metabolico che ha la possibilità, comportandosi da induttore, di legarsi al repressore, il quale va incontro a cambiamenti conformazionali (transizione allosterica) che abbassano l'affinità del repressore per le sequenze dell'Operatore, di fatto staccandosi dalle sequenze dell'operatore stesso. La RNA polimerasi è così in grado di scorrere lungo la sequenza genica e permettere la produzione di β-galattosidasi, β-galattoside permeasi, e β-galattoside transacetilasi, che metabolizzano il lattosio. Quando i livelli di lattosio si abbassano, l'induttore si stacca dal repressore che così può legarsi nuovamente all'operatore, interrompendo la trascrizione.

Appunti presi a lezione

Operone lac in Escherichia coli

lacI — lacO — lacZ — lacY — lacA

Organizzazione dei geni lac: messaggero policistromico, i ribosomi si attaccano alla Shein-Dalgarno, producono la proteina e poi si staccano x3 lacI lacO lacZ lacY lacA.

Permeasi, β-Galattosidasi, β-Galattoside transacetilasi.

Gene lacI: codifica il repressore, trascritto a partire dal proprio promotore debole, pochi repressori sintetizzati, e finisce al terminatore a valle di lacI.

Dopo, c'è il promotore lac, da dove possono partire le trascrizioni dei geni strutturali lacY, lacZ e lacA. Dopo c'è l'operatore, il sito dove si attacca il repressore. Il gene lacI è costitutivo → viene trascritto sempre, sia in presenza che in assenza di lattosio; è trascritto a partire da un promotore debole, quindi c'è una bassa quantità di repressore.

In assenza di lattosio non c'è necessità di trascrivere demolitori di lattosio; il repressore si lega all'operatore: impedisce fisicamente al fattore sigma dell'RNA polimerasi di legarsi al promotore. In presenza di solo lattosio: la poca permeasi che c'è sulla superficie cellulare lo porta dentro, il repressore deve lasciare strada libera: si distacca dall'operatore, cioè deve cambiare la sua struttura 3D (sentendo il lattosio) cioè si lega al lattosio stesso; è il lattosio che cambia la struttura al repressore che non può più legarsi all'operatore. Il fattore sigma può legarsi al promotore e permette la trascrizione dell'operone per il lattosio.

Operone: un gruppo di geni coinvolti nella stessa via metabolica, localizzati nella stessa regione del cromosoma/genoma; trascritti in un unico messaggero poligenico/policistronico a partire da un unico promotore localizzato a monte del primo gene dell'operone e controllati da sequenza regolativa chiamata operatore. Concetto di sintesi coordinata ed equimolare dei geni regolativi; quantità di enzimi equimolare → non è così. La velocità di reazione è dettata dall'enzima più veloce, si presuppone che gli enzimi abbiano la stessa velocità quindi la stessa Km.

Tutti i batteri hanno i geni organizzati in operoni? Ci deve essere anche un controllo positivo: la cellula deve sentire non solo la presenza del lattosio ma anche del glucosio. Se c'è la strada è aperta ma non può partire la trascrizione; se non c'è, la strada è aperta e può partire la trascrizione. La cellula non capta direttamente la presenza di glucosio, bensì grazie alla adenilato ciclasi → la cellula capta tramite proteina CAP la variazione di concentrazione del AMPc. CAP se è legata a AMPc, cambia conformazione e attiva i sistemi per utilizzare altri fonti di energia (lattosio). Il complesso CAP-AMPc si lega al promotore e ne modifica localmente la struttura, così che il fattore sigma riconosca efficientemente il promotore.

La regione ha 3 siti importanti: Repressore ha due siti di legame: DNA e lattosio; lega in assenza di lattosio l'operatore. Se è legato al lattosio cambia la sua conformazione → repressore = molecola allosterica. Il repressore è codificato dal lacI. Tutte le mutazioni del lacI danno fenotipo lac costitutivo? NO. Perché il repressore ha due siti di legame: se la mutazione colpisce il sito di legame del lattosio, questo rimane sempre attaccato all'operone, fenotipo lac-.

Come possono dimostrare che c'è un unico promotore a monte del gene lacZ e non 3 promotori diversi a monte di lacZ lacY e lacA?

Come fanno a capire che lacI codifica il repressore e O è dove si lega? Coniugazione nei batteri: ceppi F-, F+, HFR donatori hanno fattore F integrato nel cromosoma, F’ con fattore F che era integrato nel cromosoma, che però si è exciso. Cellula diventa parzialmente diploide. Ceppo ricevente F- che è mutato in lacZ, fenotipicamente lac-; Ceppo ricevente O funzionante, ceppo donatore O mutato. Cosa si aspettano Jacob e Monod: schema operone ricevente, schema operone donatore. Per capire la funzione di O: O sequenza che codifica il repressore I: sequenza al quale si lega il repressore. Sequenza O del cromosoma: funzionante. In assenza di induttore: è tutto spento. J e M trovano che in assenza di induttore c'è attività di galattosidasi.

Presenza / assenza lattosio: presenza. In di induttore (lattosio), la sequenza cromosomica da un repressore funzionante ma legato. Funzionamento dell'operon per il lattosio in presenza di lattosio. Figura 17.7 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A. Assenza di induttore, se I è la sequenza che codifica il repressore, sul cromosoma da un repressore funzionante e su F’ non funzionante. In assenza di induttore è tutto spento: quindi I codifica il repressore. Mutazioni polari: sono sempre non senso. Mutazioni non senso: codone di stop di traduzione. Possono cadere in lacZ, Y e A. Mutazione in Z: galattosidasi alterata, né permeasi né transacetilasi. Mutazione in Y: permeasi alterata, manca la transacetilasi. Mutazione in A: transacetilasi alterata.

Il promotore è uno solo a monte di lacZ → Come una mutazione non senso può bloccare la trascrizione di geni che stanno a valle? Terminatori Rho indipendenti. Terminatori Rho dipendenti. Operone lac: catabolico. Funzionamento dell'operon per il lattosio in assenza di lattosio. Figura 17.5 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A. Tutte le mutazioni polari sono non senso. Le mutazioni non senso non sono per forza polari.

Biosintesi degli amminoacidi in E. coli

Quando un amminoacido non è presente sul terreno, E. coli attiva i geni per la sua biosintesi; quando è presente sul terreno, E. coli disattiva i geni per la sua biosintesi.

Superrepressione Nei mutanti I non si esprimono i geni per il lattosio, né in presenza né in assenza di lattosio. Figura 17.10 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A. Super-repressione Nei mutanti I non si esprimono i geni per il lattosio, né in presenza né in assenza di lattosio. Figura 17.10 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A. Diploidia parziale nello studio dell'operone.

Sintesi regolabile Sintesi costitutiva.

1. Una mutazione costitutiva che mappa a monte di p: I. Sintesi regolabile. Dipende dalla mancanza di una proteina, che è presente nell'eterozigote. I è la mutazione di un gene regolatore.
2. Una mutazione costitutiva che mappa a valle di p: oC. Sintesi costitutiva. Se dipendesse dalla mancanza di una proteina, l'eterozigote ce l'avrebbe, e avrebbe fenotipo a+ o è la mutazione di un sito regolatore del DNA.

Operone per il triptofano

• Regolazione negativa: con repressore
• L'operone è composto da 5 geni strutturali
• TrpR è prodotta da un gene distante dall'operon
• Da sola non è in grado di legarsi al sito o (aporepressore)
• Quando è legata a molecole di trp, si lega al sito o e inibisce la trascrizione (ne riduce i livelli di 70 volte)

Regolazione per attenuazione. L'assenza di membrana nucleare permette che la traduzione cominci a trascrizione in corso. Questo permette, a sua volta, di regolare la trascrizione in funzione della posizione del ribosoma sul DNA. È fondamentale il ruolo di un sito attenuatore, nella regione leader del messaggero.

L'operon per il triptofano in E. coli

Figura 17.15

Il messaggero può assumere tre conformazioni diverse a seconda della concentrazione di triptofano. Il cambio di conformazione agisce sui livelli di trascrizione. Il messaggero può assumere tre conformazioni diverse a seconda della concentrazione di triptofano. Il cambio di conformazione agisce sui livelli di trascrizione. Figura 17.16

Attenuazione: quando il ribosoma non si ferma ai codoni UGG si interrompe la trascrizione a monte dei loci strutturali. Attenuazione: quando il ribosoma non si ferma ai codoni UGG si interrompe la trascrizione a monte dei loci strutturali.

trp-tRNA carichi: prosegue la traduzione, la trascrizione si interrompe. Figura 17.17 (b)

Caso contrario. Quando il ribosoma si ferma ai codoni UGG la trascrizione continua ai 5 loci strutturali. Quando il ribosoma si ferma ai codoni UGG la trascrizione continua ai 5 loci strutturali. trp-tRNA scarichi: blocco della traduzione, la trascrizione continua. Figura 17.17 (a)

Riassumendo. Triptofano abbondante. L'aporepressore si lega al trp e così attivato va a occupare il sito o, inibendo la trascrizione.