Enzimi e cinetica enzimatica

ENZIMI E

CATALISI

ENZIMATICA

ENZIMI

I sistemi viventi sono caratterizzati da un’enorme varietà di

reazioni biochimiche, la maggior parte delle quali viene mediata

da una serie di eccezionali catalizzatori biologici conosciuti con il

nome di enzimi (si conoscono altri catalizzatori come i ribozimi e

abzimi).

I ribozimi sono una speciale classe di RNA che hanno attività

enzimatica e che catalizzano varie reazioni soprattutto nel

metabolismo dell’RNA e nella sintesi proteica.

Un abzima è un anticorpo monoclonale con capacità catalitiche.

È detto anche catmab (sempre dall'inglese catalitic monoclonal

antibody = anticorpo monoclonale catalitico). Gli abzimi possono

essere prodotti artificialmente, ma sono stati anche trovati nel

nostro organismo, come alcuni anticorpi peptidici intestinali anti-

vasodilatatori. Gli abzimi artificiali fanno parte della categoria

degli enzimi sintetici. ENZIMI

Gli enzimi di differenziano dai normali catalizzatori chimici

per alcuni punti importanti:

1. Velocità di reazioni più elevate. Le velocità delle reazioni

catalizzate dagli enzimi sono di solito da 10 a 10 volte

6 12

maggiori delle corrispondenti reazioni non catalizzate e sono

di almeno qualche ordine di grandezza più veloci rispetto alle

corrispondenti reazioni catalizzate chimicamente.

ENZIMI

Gli enzimi di differenziano dai normali catalizzatori chimici

per alcuni punti importanti:

2. Condizioni di reazione più moderate. Le reazioni

catalizzate enzimaticamente avvengono in condizioni

relativamente moderate: temperature inferiori a 100°C,

pressione atmosferica e pH vicino alla neutralità. Al contrario

una catalisi chimica efficiente richiede spesso temperatura e

pressione elevate e valori di pH estremi.

3. Maggiore specificità di reazione. Gli enzimi hanno un

grado di specificità molto più elevato nel riconoscimento sia

dei substrati (reagenti) sia dei prodotti rispetto ai catalizzatori

chimici.

4. Capacità di regolazione. Le attività enzimatiche di molti

enzimi variano quando devono rispondere a concentrazioni di

sostanze diverse dai loro substrati. I meccanismi di questi

processi regolatori includono il controllo allosterico, la

modificazione covalente degli enzimi e variazioni nelle

quantità di enzima sintetizzato.

ENZIMI

Gli enzimi formano buona parte delle

proteine conosciute e sono spesso proteine

globulari. Quasi tutti i nomi degli enzimi

terminano in "-asi" per convenzione.

• Singolo enzima: Ureasi;

• Complesso enzimatico: Piruvato

deidrogenasi.

Gli enzimi sono classificati in:

• Idrolasi: gli enzimi che tagliano un substrato mediante idrolisi, ne

fanno parte le proteasi (che tagliano altre proteine) e le nucleasi (che

tagliano acidi nucleici, cioè DNA e RNA).

• Sintasi: enzimi che sintetizzano una nuova molecola a partire da due

substrati, generalmente per condensazione.

• Isomerasi: enzimi che trasformano un ligando in un suo isomero

modificandolo chimicamente a livello dei legami.

• Polimerasi: enzimi che associano varie molecole costituendo un

polimero, per esempio un acido nucleico.

• Chinasi: enzimi che aggiungono gruppi fosfato ad alcune molecole.

• Fosfatasi: enzimi che rimuovono gruppi fosfato da alcune molecole.

• Ossido-reduttasi: enzimi che ossidano e riducono alcune molecole,

ne fanno parte le ossidasi, le reduttasi e le deidrogenasi.

ENZIMI

IUBMB (International Union of Biochemistry and Molecular

Biology): organismo internazionale che si occupa della

classificazione funzionale e sistematica degli enzimi e della loro

denominazione: http://www.iubmb.unibe.ch

EC X.Y.Z.T

X = classe;

Y = sottoclasse;

Z = sotto-sottoclasse;

T = numero dell’enzima nella sotto-sottoclasse.

Per esempio: Alcool + NAD → Aldeide o chetone + NADH

+

• Nome comune: alcool deidrogenasi;

• Nome sistematico: alcool:NAD ossidoreduttasi;

+

• EC 1.1.1.1

Numero dell’enzima nella sotto-sottoclasse

con NAD o NADP come accettori

La sotto-sottoclasse – + +

agiscono sul gruppo di donatori CH-OH

La sottoclasse –

Ossidoreduttasi

La classe - ENZIMI

Gli enzimi catalizzano le reazioni nelle condizioni biologiche: a pH

= 7.4, a T = 37°C e nell’ambiente acquoso intracellulare.

Una caratteristica delle reazioni

enzimatiche è quella di avvenire

all’interno di una particolare tasca,

detta sito attivo; la molecola che si

lega in maniera specifica al suo

interno è detta substrato.

L’enzima diidrofolato reduttasi col suo

substrato NADP (in rosso): non legato (a

+

sinistra) e legato (a destra); l’altro substrato,

il tetreidrofolato (in giallo), è invece sempre

legato all’enzima. In questo modello, il NADP +

ENZIMI

SPECIFICITÀ DI SUBSTRATO

1. Le forze non covalenti attraverso le quali i substrati e

le altre molecole si legano agli enzimi sono lo stesso tipo

di forze che regolano le conformazioni delle proteine.

2. In entrambi i casi sono coinvolte forze di Van der Waals,

forze elettrostatiche, legami idrogeno e interazioni

idrofobiche.

3. In generale, un sito che lega il substrato è una cavità o una

fessura sulla superficie di una molecola di enzima

complementare, come forma, al substrato

(complementarietà geometrica).

4. I residui aminoacidici che formano il sito di legame

interagiscono specificatamente con il substrato mediante

forze attrattive (complementarietà elettrostatica).

5. Nella maggior parte degli enzimi, i siti di legame per il

substrato sono quasi sempre preformati, ma subiscono alcuni

cambiamenti conformazionali in seguito al legame con il

substrato (adattamento indotto).

ENZIMI

Gli enzimi sono molto specifici sia nel legare substrati chirali sia

nel catalizzare le loro reazioni. Questa stereospecificità si origina

dal fatto che gli enzimi, grazie alla loro insita chiralità (le proteine

sono costituite solo da L-aminoacidi), formano siti attivi simmetrici.

Per esempio, l’alcol deidrogenasi del lievito (YADH) catalizza

l’interconversione dell’etanolo in acetaldeide:

In questa reazione l’anello del NAD viene ridotto, portando alla

+

formazione di NADH. ENZIMI

L’etanolo è una molecola prochirale, può

diventare cioè chirale in seguito alla sostituzione

di uno dei suoi atomi di idrogeno del gruppo

metilenico. Gli atomi di idrogeno metilenici sono

chimicamente equivalenti, ma occupano nello

spazio posizioni diverse realtivamente ai

sostituenti CH e OH del carbonio metilenico e

3

quindi possono essere diversamente riconosciuti

La stereospecificità della YADH è stata dimostrata da esperimenti

dal sito attivo dell’enzima.

condotti da Westheimer e Vennesland:

1. usando etanolo deuterato si produce NADD:

ENZIMI

2. se il NADD viene isolato ed usato nella reazione inversa, il

deuterio viene trasferito quantitativamente all’etanolo:

3. se viene prodotto l’enantiomero dell’etanolo mostrato nel

passaggio precedente, questo non è in grado di trasferire il

deuterio al NAD :

+

Queste osservazioni indicano che la YADH è in grado di distinguere

tra gli atomi di idrogeno “pro-R” e “pro-S” dell’etanolo e che

trasferisce solo l’idrogeno “pro-R”.

ENZIMI

La maggior parte degli enzimi sono molto selettivi nei confronti

dell’identità dei gruppi chimici dei loro substrati. Questa

specificità geometrica è una condizione più importante della

stereospecificità.

Il grado di specificità geometrica degli enzimi può variare

considerevolmente. Un piccolo gruppo di enzimi sono del tutto

specifici per un solo composto. La maggior parte di essi, però,

catalizza le reazioni di un piccolo numero di composti molto simili

tra loro. ENZIMI

Alcuni enzimi, in particolare quelli digestivi, sono così permissivi

per quanto riguarda i substrati accettabili che è più appropriato

chiamare le loro specificità geometriche “preferenze”. Alcuni

enzimi non sono specifici neanche nei confronti del tipo di

reazione catalizzata; la chimotripsina, per esempio, oltre a

essere capace di catalizzare l’idrolisi del legame peptidico, è in

grado di idrolizzare anche un legame estere.

ENZIMI

I gruppi funzionali delle proteine possono facilmente

partecipare a reazioni acido-base, formare alcuni tipi di legami

covalenti transitori e prendere parte a interazioni carica-carica.

Essi sono invece meno adatti a catalizzare reazioni di ossido-

riduzione e molti tipi di processi che implicano il trasferimento di

gruppi. Gli enzimi possono catalizzare questo tipo di reazioni ma

soltanto se sono in associazione con piccole molecole dette

cofattori.

Alcuni cofattori, es. NAD , sono associati solo transitoriamente

+

con una certa molecola enzimatica, così da funzionare come

cosubstrati.

Altri cofattori, chiamati gruppi prostetici, sono associati in

modo permanente alla loro proteina, spesso mediante legami

covalenti. ENZIMI

ESEMPI DI ENZIMI CHE CONTENGONO COME COFATTORI IONI INORGANICI

Fe o Fe Catalasi, Citocromo ossidasi, Perossidasi

2+ 3+

Cu Citocromo ossidasi

2+

Zn Anidrasi carbonica, Alcol deidrogenasi

2+

Mg Glucosio-6-fosfatasi, Esochinasi, Piruvato chinasi

2+

Mn Arginasi, Ribonucleotide reduttasi

2+

Ni Ureasi

2+

Mo Dinitrogenasi

Se Glutatione perossidasi

K Piruvato chinasi

+

ESEMPI DI ENZIMI E COENZIMI CHE TRASFERISCONO GRUPPI CHIMICI

COENZIMA GRUPPI TRASFERITI ENZIMI

Carbossilasi

CO

Biotina 2 Acil-transferasi

Coenzima A gruppi acilici Decarbossilasi

Tiamina pirofosfato gruppi idrossialchil. Amminotransferasi

Piridossalfosfato gruppo amminico Transferasi C 1

Tetraidrofolato formil, metilen, metil

ENZIMI

I coenzimi vengono modificati chimicamente dalle reazioni enzimatiche a

cui partecipano. Per poter completare un ciclo catalitico, il coenzima deve

ritornare al suo stato originale.

Per quanto riguarda i gruppi prostetici, la rigenerazione avviene in una

fase separata dalla reazione enzimatica.

Nel caso di cosubstrati la reazione di rigenerazione può essere

catalizzata da un enzima diverso.

Molti organismi non sono in grado di sintetizzare certe porzioni della

molecola dei coenzimi essenziali; queste sostanze devono essere presenti

nella dieta dell’organismo e sono quindi chiamate vitamine.

ENZIMI

Molti coenzimi sono stati scoperti come fattori di crescita di

microrganismi o come sostanze in grado di curare malattie. Per

esempio, il componente nicotinamide del NAD o il suo

+

analogo acido carbossilico acido nicotinico (niacina) sono in

grado di curare nell’uomo la malattia fatale chiamata pellagra,

causata da una deficienza alimentare.

I sintomi della pellagra includono diarrea, dermatite e demenza.

Nella dieta umana le vitamine che sono precursori dei

coenzimi sono tutte vitamine idrosolubili, mentre le vitamine

liposolubili, come la vitamina A e D, non sono componenti dei

ENZIMI

La reazione di un atomo di idrogeno con l’idrogeno biatomico

(H ) porta alla formazione di una nuova molecola di H e di un atomo

2 2

di idrogeno diverso: H −H + H → H + H −H

A B C A B C

In questa reazione, H deve avvicinarsi alla molecola biatomica

C

H −H in modo che, ad un certo punto della reazione, esisterà un

A B

complesso ad alta energia (instabile) rappresentato da

H ∙∙∙H ∙∙∙H . In questo complesso il legame covalente H −H è in

A B C A B

procinto di rompersi, mentre il legame H −H è in procinto di

B C

formarsi.

I reagenti di solito si avvicinano l’uno all’altro seguendo il

percorso con la minima energia libera, quella che si chiama la loro

Il punto della reazione corrispondente alla maggiore energia libera è

coordinata di reazione. Un grafico con in ascissa la coordinata di

chiamato stato di transizione del sistema.

reazione e in ordinata l’energia libera è chiamato diagramma dello

stato di transizione oppure diagramma della coordinata di

reazione.

I reagenti ed i prodotti sono stati che possiedono il minimo di

energia libera, e lo stato di transizione corrisponde al punto più

alto del diagramma. ENZIMI

Se gli atomi nel sistema di reazione sono di diverso tipo,

come nella reazione: A + B → X → P + Q

‡

dove A e B sono i reagenti, P e Q sono i prodotti e X rappresenta

‡

lo stato di transizione, il diagramma dello stato di transizione non

è più simmetrico perché vi è una differenza di energia libera tra i

reagenti e i prodotti.

In entrambi i casi ΔG , l’energia libera dello stato di transizione

‡ ENZIMI

Il passaggio attraverso lo stato di transizione richiede solo

da 10 a 10 s, per cui la concentrazione dello stato di

-13 -14

transizione in un sistema di reazione è piccola. ‡

La velocità di reazione è proporzionale a e , dove R è la

-ΔG /RT

costante dei gas e T è la temperatura assoluta. Quindi, maggiore

è il valore di ΔG , minore sarà la velocità di reazione. Questo

‡

avviene perché maggiore è il valore di ΔG , minore sarà il numero

‡

di molecole di reagente che avranno sufficiente energia termica

Di solito le reazioni chimiche sono costituite da più tappe. Per

per raggiungere l’energia libera dello stato di transizione.

una reazione a due tappe come: • Se l’energia di attivazione

A → I → P

della prima tappa è maggiore

di quella della seconda tappa,

dove I è un intermedio della reazione, vi sono due stati di

la prima tappa è più lenta

transizione e due barriere energetriche di attivazione.

della seconda;

• Se l’energia di attivazione

della seconda tappa è

maggiore di quella della prima

tappa, la seconda tappa è più

lenta della seconda;

ENZIMI

In una reazione a tappe multiple, la tappa con lo stato di

transizione avente la maggiore energia libera si comporta come

un “collo di bottiglia” ed è quindi chiamata tappa che

determina la velocità di reazione.

I catalizzatori agiscono abbassando l’energia libera dello stato

di transizione della reazione che deve essere catalizzata.

La differenza tra i valori di

ΔG per la reazione

‡

catallizzata e per quella

non catalizzata ΔΔG ,

‡cat

indica l’efficienza del

catalizzatore. L’aumento

di velocità (il rapporto tra

le velocità delle reazioni

catalizzata e non

catalizzata) è dato da e

-

‡ .

ΔΔG cat/RT

Un catalizzatore abbassa la

barriera di energia libera

dello stesso fattore sia che

la reazione proceda in un

ENZIMI

Mentre un catalizzatore può accelerare la conversione dei

reagenti nei prodotti (oppure dei prodotti indietro nei reagenti), la

probabilità che la reazione netta avvenga in una direzione

o nell’altra dipende solo dalla differenza di energia libera tra i

reagenti e i prodotti.

Se il ΔG <0, la reazione procede spontaneamente dai

• reazione

reagenti verso i prodotti.

Se ΔG >0, è la reazione inversa (dai prodotti verso i

• reazione

reagenti) e procede spontanamente.

Un enzima non può alterare il ΔG ; può soltanto diminuire il

reazione

ΔG per consentire alla reazione di raggiungere l’equilibrio (dove

‡

la velocità della reazione diretta e di quella inversa sono uguali)

più velocemente che se la reazione non fosse catalizzata.

ENZIMI

1. I catalizzatori riducono l’energia libera dello stato di

transizione ΔG stabilizzando lo stato di transizione della

‡

reazione catalizzata.

2. L’efficienza degli enzimi è dovuta alla loro specificità nel

legare i substrati combinata alla disposizione dei gruppi

catalitici.

I tipi di meccanismi catalitici utilizzati dagli enzimi sono

stati classificati come:

• catalisi acido-basica;

• catalisi covalente;

• catalisi favorita da ioni metallici;

• catalisi elettrostatica;

• catalisi favorita da effetti di prossimità e di orientamento;

• catalisi favorita dal legame preferenziale del complesso dello

stato di transizione. ENZIMI

La CATALISI ACIDA GENERALE è un processo in cui il

trasferimento di un protone da un acido abbassa l’energia libera

dello stato di transizione di una reazione. Per esempio, una

reazione di tautomerizzazione cheto-enolica avviene molto

lentamente a causa dell’elevata energia libera dello stato di

transizione che ha una struttura simile a un carboanione. La

donazione di un protone all’atomo di ossigeno riduce il carattere

carbanionico dello stato di transizione, accelerando in questo

modo la velocità di reazione.

ENZIMI

U