Crocette e domande aperte strutture di Strutture bioartificiali e biomimetiche

Caratterizzazione delle microcapsule per il rilascio di cellule nell'organismo

Come caratterizzazione si può eseguire un test live/dead per verificare la vitalità cellulare a seguito dell'incapsulamento, in quanto il processo (sforzi di taglio nell'ago della siringa, ecc.) potrebbe averne influenzato la vitalità. In questo modo è possibile verificare anche che l'idrogelo permetta gli scambi necessari di gas, nutrienti e prodotti di scarto per garantire la vitalità cellulare fino al momento della degradazione della goccia. Potrebbe anche essere eseguito un test di degradazione, per verificare che le tempistiche di degradazione siano adeguate alla specifica applicazione.

24. Dovendo realizzare microcapsule nelle quali incapsulare cellule che devono essere rilasciate in un specifico sito nell'organismo, indicare:

A. Quale materiale selezionereste e perché;

B. Il metodo di ottenimento;

C. Come procedereste per la caratterizzazione biologica in vitro delle microcapsule caricate.

Per la realizzazione delle

Per le microcapsule si sceglie l'alginato, perché è un materiale naturale non adesivo per le cellule (non voglio che le cellule lo colonizzino, ma devono essere in sospensione al loro interno) in grado di degradarsi e la cui reticolazione avviene grazie alla presenza di ioni calcio/bario che ne provocano il riarrangiamento in modello egg-box. Variando la concentrazione di ioni bivalenti positivi disponibili si varia l'intensità della reticolazione e quindi si influenza la cinetica di degradazione delle microcapsule.

In alternativa, si potrebbe usare un materiale pH-responsive come il chitosano. I materiali pH-responsive sono di particolare interesse per le differenze di pH presenti nel corpo, per es. per situazioni patologiche e fisiologiche. L'utilizzo del chitosano dipende da dove devono essere rilasciate le cellule. Ad esempio, per il tratto gastro intestinale non andrebbe bene, mentre se devono essere rilasciate in tessuti tumorali va bene. Per evitare meccanismi in cui

si arriva ad un pH nonfavorevole alle cellule, si utilizzano dei Sali per farlo diventare da pH dipendente a T dipendente.

A. Per l'ottenimento delle microcapsule si fa gocciolare la soluzione tramite l'impiego di una pompa asiringa e si inseriscono nel sistema anche un flusso di aria o un campo elettrico in modo che la dimensione delle gocce che si staccano non sia eccessivamente grande e in modo che sia più controllabile. In questo modo si possono ottenere delle gocce più allungate, migliorando i fenomeni diffusivi all'interno delle microcapsule.

B. Caratterizzazione biologica in vitro: si usano linee cellulari diverse, fibroblasti murini modificati per l'espressione della GFP e cellule endoteliali murine. Si effettuano test di citotossicità indiretta e di citocompatibilità diretta. A 24 e 48 ore si fa un saggio di vitalità cellulare Alamar Blue (non distruttivo).

25. (01/2023) Vantaggi cell delivery rispetto all'utilizzo dei

soli scaffold. Sviluppare un sistema per il celldrug delivery con le cellule inglobate (materiale, tecnica e caratterizzazione delle capsule).I materiali iniettabili, nell’ambito della medicina rigenerativa, forniscono due vantaggi principali:perfetto adattamento al difetto nel tessuto e impianto con procedura mini-invasiva. L’incapsulamentoviene utilizzato anche per il rilascio di cellule autologhe per la riparazione di tessuti danneggiati. L’uso dimicrocapsule degradabili rapidamente preserva i benefici dei materiali iniettabili, con limitazioni ridottein termini di diffusione (a differenza delle tecniche di incapsulamento tradizionali). Con il cell deliverynon ci si deve preoccupare più di tanto della risposta immunitaria.Sviluppo e caratterizzazione di microcapsule in alginato degradabili velocemente: la condizione digelazione dell’alginato viene sfruttata sia per incapsulamento a lungo termine che per accelerare larottura della capsula in breve tempo,

quest’ultima è determinata agendo sulla concentrazione ionica(alginato e Ca2+). Basse concentrazioni di alginato e calcio favoriscono la degradazione rapida.È importante valutare bene il tempo di degradazione della capsula (materiale e spessore), per uncorretto rilascio delle cellule. L’analisi della chimica superficiale prevede l’uso di ATR-FTIR per fornireinformazioni relative alla struttura molecolare, alla conformazione della proteina e ai legami; XPS perinformazioni relative a composizione elementare, analisi quantitativa e legami chimici,L’analisi morfologica è stata svolta con microscopio ottico, l’analisi di vitalità cellulare con saggio MTT.

26. Possibili approcci per l’incapsulamento di isole pancreatiche e per il rilascio di insulina.

Inter-vascular device: dispositivo direttamente collegato alla circolazione sistemica dell’ospite mediante anastomosi vascolari che formano uno shunt intra-venoso.

Vantaggi: vicinanza al flusso ematico con grande apporto di ossigeno e nutrienti; svantaggi: rischio di formazione di trombi e rischi collegati alla chirurgia vascolare;

Macro devices: inglobano un grande numero di isole pancreatiche. Vantaggi: uscita dell'insulina per diffusione e la facilità di espianto e ricarica; svantaggi: limitata diffusione di ossigeno e trasporto di nutrienti.

Microincapsulamento: consente l'incorporazione di singole isole o di piccoli gruppi. Vantaggi: trasporto di ossigeno e nutrienti, i costi di produzione ridotti e la facilità della produzione chirurgica; svantaggi: difficoltà di espianto per la crescita eccessiva di tessuto fibroso pericapsulare.

27. Microsfere per rilascio di insulina con cellule eterologhe; come puoi usare l'Afm per fare modifiche di superficie.

Nell'incapsulamento di insulina non è facile mantenere l'integrità funzionale dell'insulina per l'elevata sensibilità.

alle condizioni di microincapsulazione. L'incapsulazione può avvenire con carica sumicrosfere, oppure con incapsulazione diretta che genera però instabilità e possibile denaturazione perle condizioni di stress. Le microsfere per incapsulamento di insulina sono prodotte in polilattico-poliglicolico, con insulina incapsulata direttamente, senza problemi di risposta immunitaria per assenzadi cellule. Infine, l'incapsulamento cellulare può essere fatto ponendo le cellule in sospensionenell'alginato, con sgocciolamento in CaCl2 per creare le capsule contenenti le cellule. Da studi inmodello animale si è dimostrata stabilità delle microcapsule senza difetti, con formazione di neovasiper la vascolarizzazione. L'atomic force microscopy (AFM) fornisce un profilo 3D della superficie suscala nanometrica e misura le forze di interazione tra una sonda acuminata e la superficie del campionea cortissima distanza. La creazione di un

Il pattern superficiale topografico e chimico è un potente strumento per la regolazione della funzione cellulare e il controllo di scala e pattern. Le superfici microstrutturate fungono da contact guidance in cui il comportamento delle cellule dipende dai segnali di superficie. Le caratteristiche alla nanoscala possono influenzare l'adesione, la migrazione, la proliferazione e la differenziazione cellulare.

28. Iniettare un materiale che non contiene cellule per un qualche scopo (devi decidere lo scopo e il materiale da iniettare).

Si sceglie di iniettare pNIPAm: polimero thermo-responsive con solubilità inversa rispetto al calore. Questo materiale viene utilizzato per cell sheet engineering, per il distacco di cell layers in coltura. Filler iniettabili utilizzati in ambito oculistico formati da acido ialuronico.

29. Modifiche di superficie con tecnica layer by layer: funzionamento e vantaggi.

La tecnica layer-by-layer, anche detta Additive manufacturing, permette di ottenere

scaffold ostrutture dalla sovrapposizione di più ‘strati’ uno sopra l’altro. Rispetto alle tecniche tradizionalil’additive manufacturing presenta alcuni vantaggi: non utilizzo di solventi potenzialmente tossici,migliore gestione e controllo della porosità e dell’interconnessione, utilizzo di diversi materiali,possibilità di inglobare cellule o molecole durante il processo (T e P gestibili).(Svantaggi: stampare cellule layer by layer a seconda della geometria può far sì che la struttura colassi(ad es. nello stampo di un vaso). Con la tecnica layer by layer potrei avere una risoluzione minore.)

30. Indicare quali collettori si possono impiegare per l’ottenimento di uno scaffold con fibre parallele.

Per ottenere scaffold con fibre parallele si possono usare:

• Collettore cilindrico con velocità di rotazione sufficientemente elevata;
• Collettore a piastre parallele, nel gap tra le due piastre si formano le fibre

• Collettore cilindrico con campo ausiliario: le fibre si depositano sul collettore primario ma il secondo collettore aumenta l'attrazione permettendo di avere un'orientazione preferenziale.
• Modifiche di superficie per migliorare la proliferazione cellulare (muscolo scheletrico).
• Microscanalatura degli scaffold ottenuti per replica molding. Con la replica molding sono in grado di dare una direzionalità preferenziale di crescita alle cellule. Si effettua inoltre una scanalatura dell'ordine dei micron. Per la rigenerazione del tessuto muscolare non è fondamentale la tridimensionalità ma basta la bidimensionalità.
• (01/2023) Definizione Micro Contact Printing: impieghi ed esempio e materiale utilizzato.
• Tecnica soft-litografica per la modifica superficiale di uno scaffold al fine di aumentare l'interazione con le cellule. Lo stampo in PDMS viene prodotto tramite wafer in silicio microscanalati attraverso photolitography.

Dry etching. Da questi si ottengono poi strisce di fibronectina direttamente su PLLA-TMC con diverse dimensioni in base alla stampa. Si ha quindi trasferimento di inchiostro molecolare sul substrato, utile all'adesione delle biomolecole senza modificarne le proprietà. Sullo stampo in silicone si fa aderire la molecola d'interesse in contatto con il substrato. Lo scopo di questa tecnica è quello di creare un pattern di proteine adesive con una direzione preferenziale per indurre l'allineamento cellulare.

33. Approccio nervi periferici: materiali e tecnica, caratterizzazione, approcci senza scaffold.

Fibrinogeno + gelatina

Fibrina + gelatina

Per la rigenerazione dei nervi periferici è possibile utilizzare un nervo guida in PCL e gelatina. In particolare, elettrofiliamo il PCL, utilizzando un collettore cilindrico con campo ausiliario per ottenere fibre allineate; all'interno vogliamo una struttura liscia e allineata perché favorisce