Appunti completi del corso Strutture biomimetiche e bioartificiali

MEMS E ALTRI APPROCCI

Il testo fa riferimento ai sistemi di microfluidica (diametri di poche centinaia di micrometri, mimano solo una certa porzione di rete vascolare), permettono di ottenere modelli 3D caratterizzati da reti micro-vascolari con un pattern specifico che sono:

• reti perfuse mediante sospensioni di cellule endoteliali iniettate per poi colonizzare le pareti interne delle strutture;
• colonizzazione delle reti;
• formazione di un endotelio che mima quello naturale.

Sono approcci che si fermano a studi in vitro, non li impiantiamo in vivo. Possiamo vedere degli esempi:

1. È stato fatto uno stampo in silicone (verde) ottenuto partendo da un controstampo che viene ottenuto tramite tecniche litografiche. Si stampa quindi su un wafer di silicio una morfologia che sarà il negativo del risultato e sopra ad esso si versa il PDMS. Si usa il silicone e non altri materiali perché è inerte, semplice da usare, poco costoso e flessibile. Essendo flessibile e deformabile,

Avendo comportamento elastomerico, non ha deformazione plastica. Anche se applico una forza per rimuovere il controstampo dal silicio, anche se lo deformo recupera la sua forma originale.

Ottenuto lo stampo verde, verso della gelatina che voglio reticolare con mTG, la transglutaminasi e succede che inizia a reticolare. Prima che termini la reticolazione faccio stesso emi-stampo e metto le due parti di stampo di gelatina che sta reticolando uno sopra l'altro formando una struttura compatta con dei canali. Cambia colore perché mettendo insieme i due stampi non è ancora totalmente reticolata, avvicinandoli si formano dei legami tra i due emi-stampi e formano la struttura completamente reticolata (arancione).

Si vedono due linee separate che servono per creare un allineamento perfetto tra i due emi-stampi. Avvicinandoli sono più sicura che si allineino perfettamente ottenendo aree circolari. Alla fine ottengo la struttura in cui posso perfondere le cellule endoteliali nei canali.

e aderiranno alle pareti e poi possono permettere la perfusione di nutrienti nelle cellule che sono state seminate nello scaffold;

112- altro approccio è quello di usare un solo canale, quello interno rotondo. Il rosa attorno è lo scaffold realizzato in collagene. La parte con gli aghi servono per perfondere in vitro il mezzo di cultura e poi tutto lo scaffold. Nel collagene sono state inglobate cellule cancerogenee sulle pareti del canale le cellule endoteliali. Il micro-canale è meno di 1 mm e il sistema è messo dentro ad una Petri in polistirene con aghi che permettono la perfusione. Il rosa è il collagene e ci si aspetta che le cellule possano prendere nutrienti da ciò che passa nel canale. Si vede nel grafico come si andava avanti nello studio: devo capire se le cellule endoteliali aderiscono al centro del vaso e serve capire o come farle aderire. Potrebbe se no essere un problema essendo legato alla velocità, alla portata con cui si fa passare la

culturae quindi nel grafico si vede che venendostimolata, per un periodo poi si mantieneun certo shear stress che permette allecellule di aderire e di indirizzarsi verso una direzione e alla fine si ottiene vasocon cellule del tutto adese isto che l'approccio funziona si mette nelcollagene le cellule e si nota come tutte abbiano una buona vitalità cellulare intutta la massa della struttura in collagene.

3D BIOPRINTING

Tecnica molto più utilizzata perché gli altri approcci di microfluidica servono tecnichelitografiche, si deve avere la possibilità di stampare strutture su wafer di silicio che non èeconomico e diffuso. Questa tecnica è economica e si ottengono strutture non facilmenteottenibili con le tecniche litografiche.

Si tratta di realizzare costrutti con la presenza di canali, che possano facilitare l'adesionee la proliferazione cellulare e la vascolarizzazione del tessuto tramite la realizzazione dimicro-geometrie:

possibilità di scegliere tra un gran numero di tecniche di realizzazione dei pattern con materiale sacrificale (elettrospinning, 3D printing, litografia); sfruttare materiali sacrificali, sia naturali che sintetici, con caratteristiche diverse a seconda dell'applicazione di interesse: - sintetici: devono poter essere rimossi senza danneggiare lo scaffold, quindi userò quei materiali che sono facilmente dissolvibili, per esempio i termoresponsive, abbassando la T permettano di essere liquid like e posso rimuoverli (tra questi si ha pNIPAAm), oppure copolimeri a base di PEO o PEG che ha sempre la possibilità di essere rimosso con solventi appropriati; - naturali: ad esempio il gelatino, che può essere rimosso con acqua calda o enzimi specifici.transizione in cui a 37°C è gel-like e a basse temperature è liquid-like; naturali: anch'essi con transizioni ma anche altri usati per facilitare la rimozione. MATERIALI PER LE STRUTTURE SACRIFICIALI Tra i materiali si hanno: - pluronic: copolimero PEO-PPO-PEO, triblocco, che ha una transizione sol-gel come detto prima e si può rimuovere facilmente; - PVA, polivinilalcol: non è termoresponsive ma è usato anche per sistemi degradabili industriali perché si degrada in acqua. Si ottengono strutture facilmente; - Zuccheri: che sono caramellizzati, in qualche modo vetrificato e poi rimossi anche con acqua; - Gelatina: in questo caso non deve essere reticolata, perché così alzando la temperatura di qualche grado si possono rimuovere facilmente. Rispetto a tutti questi materiali, sono ottenute con tecniche di printing. In tutte le strutture si vede che si hanno strutture piane, su un solo piano (diverso da altre versioni che fanno anche 3D), e questo.

è un aspetto importante. Si riferiscono a strutture bidimensionali e dimensioni dell’ago con cui si stampa. Come dicevamo nelle lezioni vecchie, la dimensione dell’ago e la modalità con cui stampiamo in termini di dimensioni non dipende solo dall’esigenza ma anche dalla viscosità del materiale—che ho nella cartuccia—ci serve il range di dimensioni possibili a seconda del materiale utilizzato. In letteratura si vedono molti esempi. Tra questi:

• Alginato: stampandolo non ha consistenza ma ha coesione se reticolato con il calcio quindi per rimuoverlo si usa un agente che sia chelante del calcio, che rompa i legami di reticolazione con l'alginato e permette la sua rimozione. Si vedono i diametri dei canali ottenuti. Per esempio l’ultimo ha 2000 micrometri che sono 2 mm, si va da 2 mm fino a 50 micron. Questo dipende dalla soluzione, dalla viscosità, dalle condizioni con cui io vado a stampare serviranno analisi prima per capire come usare la

Stampante per canali di certe dimensioni. Si ha qui un esempio in cui le strutture sono fatte in zucchero, filamenti di vetro. Si vede un aspetto molto fragile e questo è uno dei pochi casi in cui questi autori (su Nature) hanno realizzato strutture 3D.

Per ottenere la struttura 3D con filamenti di vetro hanno inglobato questa struttura in una matrice di diversi materiali, e poi è stata eliminata la struttura interna (essendo zucchero facilmente) e si ottiene alla fine una vascolarizzazione, la zona che poi sarà perfusa (acqua per dissolvere lo zucchero). Loro hanno dimostrato che avendo vasi in diversi materiali, con live-dead si vede come le cellule vitali si dispongono attorno al canale. La struttura 3D ha permesso quasi indipendentemente dal materiale, di perfondere i nutrienti dal canale fino allo scaffold interno (PEG fotopolimerizzato è diacrilato).

Altro esempio è uno scaffold realizzato con gelatina reticolata e alginato con CaCl e si è

ottenuto un primo layer di gelatina reticolata con MBA, poi si è stampato sopra questo primo layer una struttura in alginato fatto reticolare con calcio cloruro e infine sopra un altro layer di gelatina reticolata. Ottenuto questo sandwich si è tolto l'alginato con un agente chelante del calcio ottenendo una struttura con un vaso. Dal live dead si vede che le cellule in tutto il canale sono presenti in modo omogeneo. È importante verificare con alginato che le cellule aderiscano alle pareti del canale perché esso non è adesivo alle cellule quindi devo verificare che sulla parete del canale non ci debba essere alginato e lo noto vedendo che le cellule non aderiscono. Stesso esempio fatto poi con scopo diverso, provare a vedere come in vivo uno scaffold di questo tipo possa essere collegato ad una rete vascolare già esistente nel sito di impianto. È stata presa una parte di arteria diretto collegata con colla di fibrina alla parte.

diingresso dello scaffold e poi collegato con la siringa per essere perfuso. Si vede come di fatto il sangue perfonde il legame fatto con un vasodell'animale è possibile quindi si può integrare lo scaffold con il tessuto vascolare in quelpunto, e poi controlalta la vitalità. Un altro esempio ora realizzando una strutturain agarosio più in 3D possibile. Sono 3strutture cilindriche appoggiate su due pianidiversi e poi materiale reticolato con UV peravere scaffold attorno. Si toglie poi l'agarosioe si ottiene una serie di canali pervi. Ilproblema di fondo di questi canali è che,essendo 3 canali indipendenti con ingressiseparati, non c'è connessione tra i vasi, anche se mimano una struttura ramificata(HUVEC sono cellule endoteliali umane da vena ombelicale impiantate nei vasi eMC3T3 sono preosteoblati di linea).In un altro esempio si ha unastruttura ottenuta in PVA,che di per sé è piana messain verticale per avere

l cuore. Hanno quindi pensato di utilizzare la foglia come modello per creare una struttura vascolare artificiale. Per fare ciò, hanno decellularizzato la foglia, cioè hanno rimosso tutte le cellule lasciando solo la struttura scheletrica. Successivamente, hanno immerso questa struttura in una gelatina reticolata con mTG e poi l'hanno esposta all'acqua per ottenere dei canali per la perfusione. È importante notare che è stato utilizzato il PBS anziché l'acqua, poiché l'uso dell'acqua potrebbe danneggiare la vitalità cellulare all'interno della gelatina reticolata. Questo approccio di decellularizzazione permette di ottenere strutture che possono essere utilizzate per sviluppare reti con le geometrie desiderate.