clonaggio e PCR tecnologie ricombinanti

I vettori per il clonaggio dei geni servono per amplificare il DNA che ci interessa, si

utilizzano piccoli frammenti di DNA (plasmidi) o si usano vettori fagici. I plasmidi hanno

dimensioni diverse alcune sono grandi altri piccoli, si hanno due grosse categorie gli high

copy number e i low copy number. Più è grande il vettore più sarà un low copy number

Marker di selezione sono i geni che conferiscono la

resistenza verso un antibiotico specifico questo perché poi

la resistenza è utilizzata per riconoscere i batteri su cui

vengono inseriti i vettori mettendoli su un terreno con

antibiotico

Di solito dei batteri che vengono usati, solo una piccola percentuale riceve il vettore

(batteri ricombinanti), solo questi batteri sono in grado di crescere in terreno antibiotico,

si solito i trasformanti hanno solo una resistenza.

Propagazione del vettore nei batteri con i plasmidi essi si replicano del batterio e durante

la divisione cellulare vengono divisi nelle cellule figlie, con l’episoma invece si ha

un’integrazione del vettore nel genoma dell’ospite

Grandezza dei plasmidi si misura in kbase, in base a cosa si vuole fare si decide che

grandezza utilizzare, vettori molto grandi usati per clonare frammenti di DNA molto

grandi, vettori molti grandi si replicano in tanto tempo, tutti i plasmidi possiedono una

serie di geni che codificano elementi necessari sufficienti alla loro duplicazione

Fagi due tipi il fago con testa e coda (la

teste contiene il DNA che viene iniettato

attraverso la coda) e fago filamentoso

(rivestimento proteico con dento la

molecola di DNA che interagisce

direttamente con le molecole del

capside)

I vettori derivanti da M13 (fago filamentoso) sono molto utili per il phage display per fare

studi di interazione proteina - proteina

Purificazione del DNA si ha una grande quantità di DNA dentro i batteri, per ottenere quel

DNA bisogna purificare i plasmidi, per farlo bisogna isolare i vettori dal resto della cellula

procariote, per farlo si parte dalla coltura batterica e si fa una centrifugazione del

composto, a questo punto si lisa con determinati buffer (memoria tampone) e si isola

dalla miscela solo il DNA d’interesse e si concentra per ottenere una soluzione ad alta

concentrazione

Se si semina i batteri si prendono le colonie dentro una provetta con terreno liquido si fa

crescere (incubazione a 37 C°) per una notte ottenendo così una grande quantità di

batteri, di solito la soluzione dopo la notte è torbida indicando così che i batteri sono

cresciuti

Per calcolare la concentrazione di batteri nel terreno di coltura si usa un’analisi

spettrofotometrica, ovvero si misura l’assorbanza della luce; un fascio di luce viene

proiettato attraverso la provetta e in base alla luce d’uscita si ottiene un output e quindi l’intensità

della luce che esce sarà inferiore, conoscendo la lunghezza d’onda e le proprietà fisiche del mezzo

(provetta) si ottiene così la percentuale di concentrazione della coltura. Esiste una relazione tra

assorbanza e luce incidente, tramite un algoritmo si ottengono così i valori di ciò che si sta

misurando, se si misurano diversi composti si ottengono diverse letture.

Retta di taratura

Fasi di purificazione:

Centrifugazione, la velocità di centrifuga dipende dalla grandezza di ciò che



vogliamo separare

Al termine della centrifugazione si ha l’isolamento dei batteri

 Si rompono i batteri per ottenere il DNA all’ interno, si può fare sia in



maniera fisica che chimica

Si ottiene una soluzione di DNA puro

 Isolare utilizzando una miscela di fenolo, si ottiene così una fase acquosa di



DNA e RNA, il fenolo non si mescola con l’acqua, si ha netta divisione

Utilizzo della cromatografia a scambio ionico:



sfruttiamo le caratteristiche chimico fisiche del DNA che è

carico negativamente, si utilizzano sfere cariche

positivamente che attraggono il DNA, per staccare le

molecole di DNA dalle sfere si utilizza una soluzione ad

alta concentrazione di sale

Un’altra tecnica è:

 Misurazione della



concentrazione del DNA per

calcolare quanto DNA ho si utilizza lo spettrofotometro misuro quindi lo

spettrofotometro

Come si si sola il DNA plasmidico le dimensioni

sono un fattore discriminante, il DNA batterico è

molto più grande e ha una conformazione diversa, si

utilizza una forza di gravità diversa per far

precipitare i componenti più gradi, si può isolare sul

fondo il genoma dell’ospite da quello dei plasmidi, il

DNA plasmidico è super avvolto aumentando la densità distinguendolo dal vettore

rispetto al genoma dell’ospite Isolamento del DNA attraverso un

intercalante che è fluorescente ed

è formata da strutture cicliche e

conferisce quindi una struttura

piatta che a contatto con il DNA si

va a legare con i legami H

rendendolo visibile e identificabile

all’interno della soluzione

Isolamento del DNA fagico si sfruttano le differenze di dimensioni tra un virus rispetto a

una cellula procariotica, si utilizza quindi la centrifuga facendo precipitare i batteri che