clonaggio e PCR tecnologie ricombinanti

Clonare un gene

Cosa vuol dire clonare un gene? Può significare avere a disposizione del materiale genetico, un genoma di interesse che deve essere analizzato, e produrre grandi quantità di materiale genetico che si vuole analizzare.

Colonia e picking automatizzato

Colonia: creare una progenie identica derivante da una singola cellula (di solito batteri).

Il picking automatizzato serve allo studio del genoma di un microorganismo.

Libreria genica

La libreria genica consiste nel pickare tutte le colonie che hanno un frammento di DNA che stiamo studiando e nel metterle nelle piastre di coltura con dei pozzetti. Se si è interessati a una singola sequenza del genoma del microorganismo che si sta studiando, abbiamo una libreria ovvero una serie di cloni che rappresentano il genoma del microorganismo.

Noi non sappiamo dove sia il genoma che vogliamo studiare. Un metodo è quello di trasferire una parte di colonia su un filo di nylon che permette di trasferire piccole quantità di colonie e si mettono a contatto con un frammento della sonda marcata del frammento che stiamo cercando. Si mette a contatto la sonda con i vari pozzetti.

Una volta che si è generata una libreria genomica, abbiamo delle tecniche a nostra disposizione che ci permettono di identificare in quale dei pozzetti c’è il clone che vogliamo studiare.

Nuovo processo: utilizzo della PCR

Il nuovo processo prevede l'utilizzo della PCR (reazione a catena della polimerasi), una reazione a catena che si ripete nel tempo e che è molto utile perché permette di clonare solo una sequenza genica a cui siamo interessati.

Fasi principali della PCR

• Fase di denaturazione: con fonte di calore (95-98 °C). Si deve permettere ai primer di interagire con le corrispettive parti del DNA. Per far ciò, si abbassa la temperatura in modo tale da permettere l’interazione primer-DNA. La temperatura di interazione cambia da PCR a PCR (tra i 50 e i 60 °C).
• Dopo l’abbassamento della temperatura inizia la polimerasi. Ogni polimerasi lavora in maniera ottimale a determinate temperature. La polimerasi è un enzima, di solito termostatica. Gli estremofili sono batteri da cui inizialmente sono state isolate le prime polimerasi poiché organismi in grado di sopravvivere in ambienti proibitivi.
• La polimerasi ha un tempo di sintesi. La sintesi dipende dalla lunghezza del DNA: più lungo è il frammento del DNA, più ci metterà la polimerasi a sintetizzare il pezzo di DNA (di solito 500 basi vengono sintetizzati in 3 secondi). Più la polimerasi è lenta, più è accurata la sintetizzazione.
• Dopo la fase di sintesi (estendere la sequenza dei primer per avere la copia dello stampo), si ricomincia il ciclo e si riparte.