Clonaggio genico

IL DNA RICOMBINANTE

Clonare un frammento di DNA significa produrre una quantità elevata di sequenze di DNA identiche a quelle di partenza. La parola "clone" deriva dal termine greco "klon", che significa germoglio o ramoscello. In biologia indica la possibilità di duplicare il patrimonio genetico di qualsiasi essere vivente.

Si definisce clone un insieme di molecole di DNA, di cellule o di interi organismi, che derivano, per duplicazioni successive, da un unico progenitore di cui risultano copie identiche.

Ci sono diverse ragioni che spingono un ricercatore a clonare dei frammenti di DNA, ad esempio:

• Per produrlo in quantità virtualmente illimitate.
• Per utilizzarlo come sonda in esperimenti di ibridazione.
• Per determinarne la sequenza nucleotidica.
• Per produrre in un sistema cellulare o animale la proteina codificata da un gene.
• Per aggiungere un'informazione genetica ad un modello cellulare o animale (animali transgenici, terapia genica).

Per modificare un'informazione genetica in un modello cellulare o animale (processo chiamato knock-out).- Per creare sequenze di DNA diverse da quelle esistenti in natura (processo chiamato mutagenesi).

Per clonare un frammento di DNA servono alcuni elementi, in particolare:

• Il frammento di DNA.
• Una cellula ospite.
• Una molecola di DNA vettore.

10 dicembre 2021

L'estrazione del DNA umano può avvenire tramite diversi processi, i più frequenti sono quelli che utilizzano il sangue oppure la saliva. Ad esempio, nel caso della saliva, si vanno a prelevare delle cellule della mucosa presente nella bocca, ciò tramite un apposito tampone.

Per poter clonare il DNA genomico bisogna però prima frammentare le grandi molecole in sequenze molto più brevi, per fare ciò sono presenti diversi metodi, tra cui quello del Sonicatore, ovvero uno strumento che emette onde sonore ad una particolare lunghezza d'onda, all'interno del quale si può

inserire il DNA in modo tale dapoterlo frammentare in sequenze più brevi. Il sonicatore viene utilizzato peròsolamente in condizioni particolari, come quando si vuole sequenziare ilgenoma umano tramite le NGS.

In laboratorio, per andare a frammentare ilDNA, si utilizzano più comunemente leendonucleasi di restrizione, dette ancheenzimi di restrizione, sono degli enzimi cheesistono in natura, tipicamente sonocodificati da cellule batteriche che durantel’evoluzione hanno sviluppato dei meccanismidi difesa da parte di organismi patogeni,come ad esempio i batteriofagi.

Gli enzimi di restrizione sono in grado diandare a riconoscere determinate sequenze(solitamente formate da 4-8 nucleotidi)presenti all’interno del genoma virale e diandare ad effettuare il taglio in determinatipunti. Il genoma virale così tagliato viene inattivato e non è più in grado diesprimere un ciclo litico o lisogeno, si può quindi dire che il sistema

deglienzimi di restrizione è un meccanismo difensivo sviluppato da alcune cellule batteriche per difendersi dagli organismi patogeni. Si parla di sistemi di restrizione-modificazione batterici, detti RM, essi comprendono:

• Un endonucleasi di restrizione di tipo II che taglia il DNA a livello di una specifica sequenza del DNA stesso, ciò solamente quando le basi del DNA non sono metilate.

Domanda: perché gli enzimi di restrizione tagliano il DNA esogeno e non quello del batterio?

Questo perché sarebbe un suicidio per la cellula batterica stessa, la quale, oltre ad aver sviluppato i meccanismi di restrizione, produce anche una DNA metilasi, ovvero un enzima in grado di riconoscere le stesse sequenze riconosciute dagli enzimi di restrizione ed è in grado di metilare. In questo modo, le sequenze metilate non vengono riconosciute e quindi tagliate dell’enzima di restrizione.

Circa ¼ dei batteri studiati possiede un sistema di restrizione-modificazione e tra

questi più del 50% produce più di un tipo di enzima direstrizione. Alcuni virus hanno sviluppato dei meccanismi per resistere ai sistemi direstrizione e modificazione, generalmente modificando il proprio DNA aggiungendo gruppi metile o glicosidici alle sequenze riconosciute dagli enzimi di restrizione, bloccando così gli enzimi di restrizione stessi. Altri virus, come ad esempio i batteriofagi T3 e T7, sono invece in grado di codificare per proteine che inibiscono gli enzimi di restrizione. Un esempio di sito di restrizione è quello dell’enzima BamH1: la sequenza individuata dagli enzimi di restrizione è identificata da sei nucleotidi, ovvero GGATCC, in seguito al riconoscimento e al taglio da parte degli enzimi di restrizione le estremità della sequenza non vengono lasciate piatte ma si creano delle sporgenze con forme specifiche. Quindi ovunque si trovi un sito di restrizione BamH1, l’enzima opera un taglio a singolo filamento in ciascuno.

dei filamenti della molecola di DNA duplex. Ciascun taglio crea delle nuove estremità 3' e 5', separando il duplex in due frammenti. Nel caso particolare di BamH1, i tagli sono sfalsati, in modo che le estremità prodotte terminano con regioni a singolo filamento, della lunghezza di quattro nucleotidi. Nel 1978, il premio Nobel per la medicina fu vinto da Werner Arber, Daniel Nathans e Hamilton Smith, per la scoperta degli enzimi di restrizione e della loro applicazione nell'ambito della genetica molecolare. Una caratteristica degli enzimi di restrizione è quella di riconoscere le sequenze palindromiche, il termine palindromo indica generalmente delle parole o delle frasi leggibili indifferentemente da sinistra a destra o da destra a sinistra. Degli esempi di parole palindromiche possono essere: ingegni, ossesso, kayak e aerea (la più lunga parola palindromica conosciuta in tutto il mondo è Saippuakauppaias, ovvero finnico, che significavenditore di sapone. Le parole palindromiche sono caratterizzate dal fatto di presentare un asse centrale di simmetria, che divide la parola o la frase in due parti che sono una l'immagine speculare dell'altra. Delle sequenze di basi azotate palindromiche possono essere presenti anche nelle molecole di acidi nucleici, infatti presentano la stessa sequenza sia che siano lette da 5' a 3' sia che siano lette da 3' a 5'. Frequenze di taglio e la dimensione media dei frammenti di DNA: la maggior parte degli enzimi di restrizione riconosce sequenze di DNA lunghe 4, 6 oppure 8pb, la lunghezza della sequenza di taglio determina la frequenza media di taglio di una molecola di DNA. Assumendo che la frequenza delle quattro basi nel DNA sia la stessa e che la distribuzione delle quattro basi che compongono il DNA sia casuale, in ogni posizione del DNA ci sarà 1 probabilità su 4 di trovare una delle quattro basi. La frequenza di taglio è uguale a 1/4.dove n è uguale al numero di nucleotidi_{ndel sito di riconoscimento.}Le mappe di restrizione sono delle sequenze di DNA con indicate le posizioni ditaglio di uno o più enzimi di restrizione. Dove si prendono gli enzimi di restrizioni? Gli enzimi di restrizione esistono in natura, non sono stati inventati ma scoperti, ma ormai da parecchi anni gli enzimi di restrizione vengono venduti direttamente da delle aziende specializzate nella produzione di enzimi. Un esempio di azienda che vende enzimi di restrizione è la BioLabs, la quantità di enzimi di restrizione viene indicata per unità, ovvero la quantità di enzimi che servono per svolgere il loro compito in un'ora. Gli enzimi di restrizione hanno una data di scadenza, circa diversi mesi o un anno. Gli enzimi di restrizione sono molecole particolarmente costose, vengono comunemente utilizzati in tutti i laboratori del mondo come forbici biologiche. Ogni enzima di restrizione funziona nel migliore dei casi solo su una specifica sequenza di DNA.

modi ad una temperatura ottimale, ovvero la temperatura ottimale di crescita del batterio da cui è stato estratto quel determinato enzima di restrizione. Un esempio di enzima di restrizione detto Tac-1, estratto da un batterio termofilo, che vive in condizioni ottimali intorno ai 70°C.

Se si conosce a priori la sequenza di un frammento di DNA che si vuole tagliare si può generare una mappa di restrizione, ponendo la sequenza in un software, ovvero una sequenza di DNA con indicate sequenze palindromiche e quindi le posizioni di taglio di uno o più enzimi di restrizione.

Possono verificarsi delle problematiche, come il malfunzionamento degli enzimi di restrizione o la loro scadenza, dopo aver utilizzato gli enzimi di restrizione per creare un taglio bisogna quindi verificare che il taglio sia avvenuto correttamente, infatti non bisogna mai pensare che un esperimento sia avvenuto correttamente senza averne le prove. Per verificare che un frammento di DNA sia stato veramente digerito da

Un enzima di restrizione si utilizza nell'elettroforesi del DNA su gel di agarosio. Il gel di agarosio è una sostanza gelatinosa, formata da polisaccaridi di agarosio che vengono tipicamente disciolti in una soluzione tampone e portati a ebollizione. Successivamente, questa soluzione viene versata in uno stampo in modo da ottenere uno strato sottile di gel.

Prima di versare la soluzione nello stampo, bisogna porre in una delle due estremità del contenitore un pettine, ovvero un pezzetto di plexiglas che ha la forma di un pettine a causa delle sue dentature. Questo pettine permette, una volta che il gel di agarosio si è solidificato, di ottenere dei pozzetti nel gel di agarosio.

Alle due estremità dello stampo sono posti due fili di platino che verranno collegati a un alimentatore, il quale permette di far passare la corrente da un polo negativo ad un polo positivo. Per fare sì che ciò avvenga, bisogna riempire l'apposito contenitore, posto nello stampo.

con una soluzione salina, la quale permette il passaggio della corrente da un polo all'altro. Prima di attivare l'alimentatore si va a porre nei pozzetti una piccola quantità di DNA, le cui molecole migreranno verso il polo positivo, infatti il DNA ha una carica negativa dovuta alla presenza dell'acido fosforico. Nel muoversi verso il polo positivo, le molecole di DNA verranno rallentate dal gel di agarosio, in questo modo le molecole di piccole dimensioni si riescono a muovere molto più velocemente verso il polo positivo, mentre le molecole di DNA con dimensioni maggiori verranno rallentate maggiormente. Per consentire la visualizzazione ad occhio nudo degli acidi nucleici migrati si possono utilizzare diversi tipi di.