Clonaggio genico

Il DNA ricombinante

Clonare un frammento di DNA significa produrre una quantità elevata di sequenze di DNA identiche a quelle di partenza. La parola “clone” deriva dal termine greco “klon”, che significa germoglio o ramoscello. In biologia indica la possibilità di duplicare il patrimonio genetico di qualsiasi essere vivente. Si definisce clone un insieme di molecole di DNA, di cellule o di interi organismi, che derivano, per duplicazioni successive, da un unico progenitore di cui risultano copie identiche.

Ci sono diverse ragioni che spingono un ricercatore a clonare dei frammenti di DNA, ad esempio:

• Per produrlo in quantità virtualmente illimitate.
• Per utilizzarlo come sonda in esperimenti di ibridazione.
• Per determinarne la sequenza nucleotidica.
• Per produrre in un sistema cellulare o animale la proteina codificata da un gene.
• Per aggiungere un’informazione genetica ad un modello cellulare o animale (animali transgenici, terapia genica).
• Per modificare un’informazione genetica in un modello cellulare o animale (processo chiamato knock-out).
• Per creare sequenze di DNA diverse da quelle esistenti in natura (processo chiamato mutagenesi).

Per clonare un frammento di DNA servono alcuni elementi, in particolare:

• Il frammento di DNA.
• Una cellula ospite.
• Una molecola di DNA vettore.

Estrazione del DNA umano

L’estrazione del DNA umano può avvenire tramite diversi processi, i più frequenti sono quelli che utilizzano il sangue oppure la saliva. Ad esempio, nel caso della saliva, si vanno a prelevare delle cellule della mucosa presente nella bocca, ciò tramite un apposito tampone.

Per poter clonare il DNA genomico bisogna però prima frammentare le grandi molecole in sequenze molto più brevi, per fare ciò sono presenti diversi metodi, tra cui quello del sonicatore, ovvero uno strumento che emette onde sonore ad una particolare lunghezza d’onda, all’interno del quale si può inserire il DNA in modo tale da poterlo frammentare in sequenze più brevi. Il sonicatore viene utilizzato però solamente in condizioni particolari, come quando si vuole sequenziare il genoma umano tramite le NGS.

In laboratorio, per andare a frammentare il DNA, si utilizzano più comunemente le endonucleasi di restrizione, dette anche enzimi di restrizione. Sono degli enzimi che esistono in natura, tipicamente sono codificati da cellule batteriche che durante l’evoluzione hanno sviluppato dei meccanismi di difesa da parte di organismi patogeni, come ad esempio i batteriofagi.

Gli enzimi di restrizione sono in grado di riconoscere determinate sequenze (solitamente formate da 4-8 nucleotidi) presenti all’interno del genoma virale e di effettuare il taglio in determinati punti. Il genoma virale così tagliato viene inattivato e non è più in grado di esprimere un ciclo litico o lisogeno, si può quindi dire che il sistema degli enzimi di restrizione è un meccanismo difensivo sviluppato da alcune cellule batteriche per difendersi dagli organismi patogeni.

Sistemi di restrizione-modificazione batterici

Si parla di sistemi di restrizione-modificazione batterici, detti RM, essi comprendono:

• Un endonucleasi di restrizione di tipo II che taglia il DNA a livello di una specifica sequenza del DNA stesso, ciò solamente quando le basi del DNA non sono metilate.

Domanda: perché gli enzimi di restrizione tagliano il DNA esogeno e non quello del batterio?

Questo perché sarebbe un suicidio per la cellula batterica stessa, la quale, oltre ad aver sviluppato i meccanismi di restrizione, produce anche una DNA metilasi, ovvero un enzima in grado di riconoscere le stesse sequenze riconosciute dagli enzimi di restrizione ed è in grado di metilare. In questo modo, le sequenze metilate non vengono riconosciute e quindi tagliate dall’enzima di restrizione.

Circa ¼ dei batteri studiati possiede un sistema di restrizione-modificazione e tra questi più del 50% produce più di un tipo di enzima di restrizione.

Alcuni virus hanno sviluppato dei meccanismi per resistere ai sistemi di restrizione e modificazione, generalmente modificando il proprio DNA aggiungendo gruppi metile o glicosidici alle sequenze riconosciute dagli enzimi di restrizione, bloccando così gli enzimi di restrizione stessi. Altri virus, come ad esempio i batteriofagi T3 e T7, sono invece in grado di codificare per proteine che inibiscono gli enzimi di restrizione.

Un esempio di sito di restrizione è quello dell’enzima BamH1: la sequenza individuata dagli enzimi di restrizione è identificata da sei nucleotidi, ovvero GGATCC, in seguito al riconoscimento e al taglio da parte degli enzimi di restrizione le estremità della sequenza non vengono lasciate piatte ma si creano delle sporgenze con forme specifiche.

Quindi ovunque si trovi un sito di restrizione BamH1, l’enzima opera un taglio a singolo filamento in ciascuno dei filamenti della molecola di DNA duplex. Ciascun taglio crea delle nuove estremità 3’ e 5’, separando il duplex in due frammenti. Nel caso particolare di BamH1, i tagli sono sfalsati, in modo che le estremità prodotte terminano con regioni a singolo filamento, della lunghezza di quattro nucleotidi.

Nel 1978, il premio Nobel per la medicina fu vinto da Werner Arber, Daniel Nathans e Hamilton Smith, per la scoperta degli enzimi di restrizione e della loro applicazione nell’ambito della genetica molecolare.

Una caratteristica degli enzimi di restrizione è quella di riconoscere le sequenze palindromiche, il termine palindromo indica generalmente delle parole o delle frasi leggibili indifferentemente da sinistra a destra o da destra a sinistra. Degli esempi di parole palindromiche possono essere: ingegni, ossesso, kayak e aerea (la più lunga parola palindromica conosciuta in tutto il mondo è Saippuakauppias, ovvero finnico, che significa venditore di sapone).

Le parole palindromiche sono caratterizzate dal fatto di presentare un asse centrale di simmetria, che divide la parola o la frase in due parti che sono una l’immagine speculare dell’altra. Delle sequenze di basi azotate palindromiche possono essere presenti anche nelle molecole di acidi nucleici, infatti presentano la stessa sequenza sia che siano lette da 5’ a 3’ sia che siano lette da 3’ a 5’.

Frequenze di taglio e dimensione media dei frammenti di DNA

La maggior parte degli enzimi di restrizione riconosce sequenze di DNA lunghe 4, 6 oppure 8 pb, la lunghezza della sequenza di taglio determina la frequenza media di taglio di una molecola di DNA. Assumendo che la frequenza delle quattro basi nel DNA sia la stessa e che la distribuzione delle quattro basi che compongono il DNA sia casuale, in ogni posizione del DNA ci sarà 1 probabilità su 4 di trovare una delle quattro basi. La frequenza di taglio è uguale a 1/4ⁿ, dove n è uguale al numero di nucleotidi del sito di riconoscimento.

Le mappe di restrizione sono delle sequenze di DNA con indicate le posizioni di taglio di uno o più enzimi di restrizione.

Produzione e commercio degli enzimi di restrizione

Gli enzimi di restrizione esistono in natura, non sono stati inventati ma scoperti, ma ormai da parecchi anni gli enzimi di restrizione vengono venduti direttamente da delle aziende specializzate nella produzione di enzimi. Un esempio di azienda che vende enzimi di restrizione è la BioLabs, la quantità di enzimi di restrizione viene indicata per unità, ovvero la quantità di enzimi che servono per svolgere il loro compito in un’ora. Gli enzimi di restrizione hanno una data di scadenza, circa diversi mesi o un anno.