Appunti Biologia molecolare - Tecniche di clonaggio - Sistema gene LAC-Z - appunti

Tecniche di clonaggio

Tecnica utilizzata per la costruzione di mappe fisiche di restrizione di interi

genomi attraverso la costruzione delle genoteche.

Genoteca: collezione di cloni che siano rappresentativi di un intero genoma.

Clone: insieme di cellule, tutte uguali, aventi lo stesso patrimonio genetico.

Per avere una genoteca completa, se si hanno ad esempio 600 frammenti che

vengono clonati, si ottengono 600 cloni diversi, ciascuno con all’interno un

vettore ricombinante contenente 1 dei 600 frammenti.

Agli inizi degli anni ’80 la tecnica è stata messa a punto utilizzando come

vettori i plasmidi purificati da batteri, i quali sono poco versatili a causa delle

elevate dimensioni e per la presenza di pochi siti di restrizione. Tali vettori di 1°

generazione sono quindi stati manipolati ed adattati (2° e 3° generazione)

creando plasmidi più versatili.

PRIMO pBR322

Il primo plasmide utilizzato fu il dotato di una doppia resistenza agli

antibiotici (ampicillina e tetraciclina); presenta pochi siti di restrizione per il

clonaggio (utilizzabili solo se presenti una sola volta e contenenti all’interno del

gene utilizzato per la selezione).

Per poter usare un enzima di restrizione nella tecnica del clonaggio, l’enzima

deve tagliare una sola volta; se taglia più volte si avrebbe la frammentazione

del sito. Si usa lo stesso enzima per tagliare anche il genoma, creando così nel

plasmide e nei frammenti del genoma delle estremità (preferibilmente

appiccicose utilizzando un enzima che tagli in modo sfalsato, facilitando la

ligazione, cioè la formazione del legame covalente tra vettore e frammento)

complementari.

Nel caso di pBR322, questo viene tagliato con lo stesso enzima ottenendo una

serie di frammenti.

Vengono quindi incubati vettori e frammenti in presenza di ATP e una ligasi a

18°C in camera fredda per 12h. Avviene la ligazione formando così molecole di

DNA ricombinante (formate dal vettore in cui è inserito uno dei frammenti del

genoma). Nella provetta avremo anche molecole in cui il vettore si è richiuso

(ricircolarizzato).

Il ligato ottenuto viene incubato in presenza di una sospensione di cellule

batteriche competenti (ossia idonee ad essere trasformate trasferimento di



materiale genetico dall’esterno all’interno della cellula).

Per rendere competenti tali cellule si utilizza un tampone di CaCl 0,1M

2

incubato con la sospensione batterica per 1h in ghiaccio (il tampone aumenta

la permeabilità della membrana). Le cellule competenti vengono quindi

incubate con il legante per 1h in ghiaccio e poi a 37° per 5 min (o 42° per 2

min), creando così uno shock termico che permette di aumentare l’efficienza

della trasformazione.

Le cellule vengono quindi seminate su terreno solito contenente un marker per

la selezione (in questo caso l’ampicillina). Sul terreno quindi: