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Tecniche di clonaggio

Costruzione di mappe fisiche

La tecnica utilizzata per la costruzione di mappe fisiche di restrizione di interi genomi avviene attraverso la costruzione delle genoteche.

Genoteca e cloni

Una genoteca è una collezione di cloni rappresentativi di un intero genoma. Un clone è un insieme di cellule, tutte uguali, aventi lo stesso patrimonio genetico. Per ottenere una genoteca completa, se si hanno ad esempio 600 frammenti che vengono clonati, si ottengono 600 cloni diversi, ciascuno con all'interno un vettore ricombinante contenente uno dei 600 frammenti.

Vettori plasmidici

Agli inizi degli anni '80, la tecnica fu messa a punto utilizzando come vettori i plasmidi purificati da batteri. Questi plasmidi di prima generazione erano poco versatili a causa delle elevate dimensioni e della presenza di pochi siti di restrizione. Tali vettori sono stati quindi manipolati e adattati, creando plasmidi più versatili di seconda e terza generazione.

Primo plasmide pBR322

Il primo plasmide utilizzato fu il pBR322, dotato di una doppia resistenza agli antibiotici (ampicillina e tetraciclina). Presenta pochi siti di restrizione per il clonaggio, utilizzabili solo se presenti una sola volta e contenenti all'interno del gene utilizzato per la selezione.

Procedura di clonaggio

Per poter usare un enzima di restrizione nella tecnica del clonaggio, l'enzima deve tagliare una sola volta; se taglia più volte si avrebbe la frammentazione del sito. Si usa lo stesso enzima per tagliare anche il genoma, creando così nel plasmide e nei frammenti del genoma delle estremità complementari. Preferibilmente, si utilizzano enzimi che tagliano in modo sfalsato, facilitando la ligazione, cioè la formazione del legame covalente tra vettore e frammento.

Nel caso di pBR322, questo viene tagliato con lo stesso enzima ottenendo una serie di frammenti. Vettori e frammenti vengono incubati in presenza di ATP e una ligasi a 18°C in camera fredda per 12 ore. Avviene la ligazione, formando così molecole di DNA ricombinante, formate dal vettore in cui è inserito uno dei frammenti del genoma. Nella provetta avremo anche molecole in cui il vettore si è richiuso (ricircolarizzato).

Trasformazione delle cellule

Il ligato ottenuto viene incubato in presenza di una sospensione di cellule batteriche competenti, ossia idonee a essere trasformate, ovvero il trasferimento di materiale genetico dall'esterno all'interno della cellula. Per rendere competenti tali cellule, si utilizza un tampone di CaCl₂ 0,1 M, incubato con la sospensione batterica per 1 ora in ghiaccio. Il tampone aumenta la permeabilità della membrana.

Le cellule competenti vengono quindi incubate con il legante per 1 ora in ghiaccio e poi a 37°C per 5 minuti (o 42°C per 2 minuti), creando così uno shock termico che favorisce l'ingresso del DNA ricombinante.