Biotecnologie delle fermentazioni industriali

Biotecnologie delle fermentazioni industriali

Introduzione

L’obiettivo delle fermentazioni industriali è utilizzare i microrganismi per un determinato scopo; alcuni microrganismi possono essere usati per ottenere prodotti fermentati a partire da diverse matrici. Importanti sono le attività metaboliche ed enzimatiche quando bisogna usare i microrganismi in un determinato contesto; i prodotti alimentari in cui c’è un intervento microbico sono tanti e per ciascuno di questi bisogna selezionare un idoneo microrganismo.

Per cercare i giusti ceppi bisogna avere dei riferimenti per capire quali sono i più idonei; si parla di microbiologia ambientale perché l’alimento viene considerato come un microambiente con una biodiversità microbica data dagli starter selezionati e poi dai microrganismi naturalmente presenti nella matrice a meno che non ci sia stato un trattamento che abbia ridotto la presenza di microrganismi endogeni.

Bisogna avere delle informazioni di tipo tassonomico, quindi bisogna sapere quali sono le specie presenti; inoltre, bisogna avere dei dati quantitativi per capire in che proporzioni sono le singole specie tra di loro nel prodotto durante il processo produttivo e nel prodotto finito. Si descrive come cambiano le proporzioni tra le popolazioni microbiche dalla matrice iniziale fino al prodotto finale in quanto si ha una situazione dinamica e la popolazione cambia nel prodotto; questo è fondamentale per ottenere il prodotto finale con determinate caratteristiche.

Inoltre, si ha anche una distribuzione spaziale delle specie microbiche nel prodotto in quanto tra esterno ed interno ci possono essere differenti microrganismi che con il loro metabolismo producono le caratteristiche desiderate. Un prodotto fermentato è un ambiente delimitato dalla sua natura fisica dove cambia la componente microbica.

Importanza della selezione dei ceppi

Quando si identifica una specie dentro un prodotto automaticamente si sa che quella specie è caratterizzata da una determinata attività metabolica, quindi una serie di informazioni che riguardano il metabolismo principale. Per andare oltre e cercare le attività metaboliche secondarie bisogna fare delle differenziazioni a livello di ceppo perché la maggior parte di queste attività che sono legate agli aspetti tecnologici di produzione, sviluppo di aromi, miglioramento della texture, protezione sono legate alla variabilità genetica e quindi fenotipica che dipende dagli individui e non dalla specie.

La difficoltà del lavoro di selezione è proprio non potersi fermare alla specie, ma bisogna scendere a un livello più basso per distinguere gli individui in funzione delle caratteristiche che si stanno cercando. Un esempio è dato dai probiotici che si trovano in diversi prodotti: le caratteristiche benefiche sono strettamente legate al particolare ceppo selezionato. Alcune caratteristiche non sono legate alla specie ma al singolo ceppo e quindi è necessaria un’attenta selezione.

Caratterizzazione genetica e attività microbiche

La caratterizzazione genetica di microrganismi porta come prima informazione alla specie e poi si possono avere differenze genetiche tra ceppi diversi; esistono tante metodologie per differenziare i ceppi e oggi quello più immediato è il sequenziamento del genoma del microrganismo che ormai è un’operazione semplice e non ha un elevato costo. Ci sono altre analisi utilizzate per analisi di routine a livello aziendale anche se ormai si tende a sequenziare il genoma dei ceppi che sono per loro i più importanti dal punto di vista commerciale e quindi si vogliono il massimo numero di informazioni.

L’analisi genomica non permette però di capire cosa il microrganismo può fare, sono informazioni che possono dare una predizione ma poi non è detto che i geni siano trascritti e regolarmente tradotti; se si producono colture selezionate per fare lo yogurt il cliente compra le colture e le innesta nel latte, se lo yogurt non si ottiene è un problema.

Quando si assumono probiotici non si ha una verifica che questi funzionano, non si ha un controllo sull’attività; in ambito alimentare è fondamentale un controllo dell’attività dei microrganismi e questo controllo prevede la messa a punto e l’uso di protocolli estremamente rigorosi. Non ci sono parametri che permettono di verificare l’attività dei probiotici.

Caratteristiche rilevanti nei ceppi

• Ci sono quindi caratteristiche che cambiano da ceppo a ceppo e sono di rilevanza in un contesto alimentare: tra le varie attività, nei prodotti a base latte lo stesso metabolismo con cui il microrganismo usa il lattosio può diversificare ceppi diversi. Tutti i microrganismi della stessa specie di S. thermophilus sanno utilizzare il lattosio (omolattica), ma cambia la velocità con cui lo zucchero viene utilizzato e questo è un parametro importante perché un processo di produzione alimentare deve essere standardizzato con lo stesso livello qualitativo e individui della stessa specie possono avere velocità differente e questa differenza è data da altre attività accessorie come la capacità di recuperare amminoacidi dal latte in quanto la fonte di azoto influisce sulla velocità di acidificazione.
• Se le cellule si moltiplicano e quindi hanno i nutrienti necessari, la velocità è maggiore, mentre se mancano nutrienti la velocità è più bassa. Non ci sono attività metaboliche disgiunte dalle altre presenti all’interno della cellula perché ogni attività è interconnessa con l’altra. Se si selezionano microrganismi per avere una velocità di acidificazione elevata, non vuol dire che quelli con velocità bassa non siano importanti perché in S. thermophilus per fare la Crescenza si ha bisogno di un processo di acidificazione più lento per ottenere la tipologia di formaggio desiderata.
• Può essere necessario avere ceppi selezionati per fare lo yogurt e che siano incapaci di utilizzare il lattosio: L. delbruckeii bulgaricus è più termofilo e quando lo yogurt viene messo in frigorifero dopo la produzione si riesce a mantenere le sue caratteristiche perché se si cambia la temperatura le cellule vengono attivate e il problema può esserci quando yogurt viene trasportato; dalla produzione al consumo si può avere una continua attività metabolica di produzione di acido lattico dal lattosio e questa acidità eccessiva che si produce cambia le caratteristiche sensoriali del prodotto in quanto diventa più acido ed è considerato un difetto.
• I microrganismi inoltre continuano ad avere proteasi che producono piccoli peptidi (L. delbruckeii); se si producono peptidi con amminoacidi idrofobici danno sapore amaro. Esistono tecnologie che consentono di selezionare L. delbruckeii che non sono in grado di utilizzare lattosio e in questo modo si ottiene yogurt ma con una biomassa che non cresce nel prodotto e non crea processi di post-acidificazione. S. thermophilus ha un metabolismo più rallentato e anche quando si hanno sbalzi di temperatura il metabolismo non parte.
• È fondamentale caratterizzare i microrganismi in base alla capacità di utilizzare proteine, quindi, si guarda il sistema proteolitico in quanto si devono avere enzimi dedicati a queste attività; ci sono ceppi con attività più efficienti e altri meno. Con un’elevata proteolisi si ha una maggiore velocità di acidificazione in quanto si ha a disposizione la fonte di azoto.
• Nel corso dei decenni il numero di S. thermophilus proteasi positivi nei prodotti alimentari è aumentato in quanto si cercano ceppi con elevata velocità di acidificazione.
• Ci sono attività enzimatiche complesse che portano all’autolisi, ovvero la lisi cellulare; questa necessità c’è soprattutto quando i ceppi batterici vengono utilizzati durante la produzione di formaggi con processi di maturazione. La maturazione di un formaggio conferisce l’aroma finale. Si può avere così il rilascio di enzimi endocellulari nella matrice; esiste quindi una serie di sistemi che conoscendo come avviene questo fenomeno (degradazione della parete cellulare con peptido-glicano-liasi) selezionano ceppi adatti.
• Gli enzimi portano alla produzione di aromi che derivano dal catabolismo degli amminoacidi; se non avviene la rottura delle cellule, la maturazione è più lenta, mentre se avviene è più breve. Dal punto di vista produttivo avere una maturazione più corta e accelerata permette di diminuire lo stoccaggio delle forme di formaggio e quindi si risparmia e si pongono sul mercato prima, si ha un fattore economico.
• Il sistema proteolitico che consente di distinguere ceppi ha anche peso sulla produzione di molecole che hanno aroma; quando si caratterizzano ceppi è importante avere una caratterizzazione completa in quanto i risvolti sono molteplici.
• Inoltre, con il sistema proteolitico si può capire se si possono generare nella matrice alimentare dei peptidi bioattivi, ovvero peptidi che mimano molecole peptidiche del metabolismo umano e che hanno una funzione biologica come endorfine, inibitori del sistema che produce l’angiotensinogeno, inibitori della crescita altri microrganismi. Avere un sistema proteolitico di un certo tipo può anche evitare di avere un eccesso di peptidi che conferiscono un sapore amaro.
• Un’altra caratteristica importante è la produzione di esopolisaccaridi che possono aderire alla cellula o che vengono rilasciati nel mezzo; la produzione è importante in alcuni contesti come lo yogurt perché migliorano le caratteristiche di texture del prodotto e consentono di ridurre la materia grassa nel latte. Selezionando dei ceppi che sono capaci di produrre EPS si ottengono yogurt magri ma che mantengono la cremosità sostituendosi alla panna. Non tutti i ceppi li producono in modo uguali ed è una delle caratteristiche più instabile in quanto può perdersi o diminuire.
• Un altro aspetto importante è che alcuni microrganismi possono produrre anche molecole che hanno capacità di inibire la crescita di altre specie microbiche e quindi possono dare un valore aggiunto all’alimento in quanto possono inibire lo sviluppo di microrganismi patogeni, quindi, si preserva la contaminazione da parte di altri microrganismi con microrganismi utili. Si ha un’attenta selezione di microrganismi che vengono utilizzati come colture di protezione. L. monocytogenens può essere controllata lavorando nel modo più pulito possibile nella produzione e utilizzando colture microbiche che vengono spruzzate sulla forma di Gorgonzola che siano in grado di colonizzare la crosta e che inibiscono lo sviluppo di L. Alcuni di questi controlli sono nati casualmente aggiungendo probiotici alla crescenza e si è visto che aveva una shelf-life molto più lunga grazie alla protezione di questi microrganismi.
• La legislazione normativa non identifica ancora le colture di protezione; queste non devono interferire sul sapore del prodotto e non devono avere attività metaboliche che interferiscono, quindi la selezione non è banale.
• I microrganismi che si utilizzano in contesti alimentari devono anche essere protetti dalle infezioni virali, quindi, dai batteriofagi che se intervengono durante un processo di produzione di una biomassa creano un danno enorme e anche durante un processo di caseificazione perché non si può ottenere il prodotto finale. I microrganismi vengono anche selezionati in funzione della loro sensibilità ai più comuni batteriofagi che sono presenti negli ambienti di produzione, quindi, si deve avere una collezione di batteriofagi per caratterizzare i ceppi che si stanno selezionando.
• Non bisogna trascurare poi l’industrializzazione: in laboratorio si possono coltivare buona parte dei ceppi delle specie che hanno un impiego alimentare; i problemi di coltivabilità si hanno con specie nuove. Il microrganismo poi deve essere prodotto come biomassa in quantità elevata e se il ceppo selezionato non si riesce a produrre in grossa quantità si ha la necessità di doverlo scartare perché il costo economico della produzione deve essere bilanciato con il guadagno delle vendite. Questo discorso vale molto per i probiotici.
• Un altro aspetto fondamentale è la sicurezza dei microrganismi in quanto negli ultimi decenni c’è stata una forte sensibilizzazione verso l’impiego di antibiotici in quanto si possono selezionare ceppi antibiotico-resistenti; se un microrganismo è resistente a un determinato antibiotico e non è patogeno questo problema non si pone perché non crea un’infezione, non ha gli strumenti per creare problematiche ma nonostante questo l’EFSA ha stabilito che i microrganismi prodotti nella catena alimentare devono essere sensibili alle molecole antibiotiche perché i geni possono essere potenzialmente trasferiti a specie patogene.
• Il concetto di antibiotico-resistenza è importante perché i microrganismi possono essere un veicolo dell’antibiotico-resistenza perché con lo scambio genico orizzontale trasferiscono la resistenza a specie che non sono patogene.

Sistemi di trasporto

Quando si parla di sistemi di trasporto bisogna considerare quelli dedicati al trasporto di qualsiasi nutriente come la fonte di carbonio e azoto; con microrganismi che hanno un interesse alimentare, si ha a che fare con microrganismi dotati di esigenze nutrizionali, ovvero sono auxtrofi per alcuni nutrienti e devono recuperarli dall’ambiente esterno con sistemi che consentono di trasportare le molecole all’interno della cellula; molecole di piccole dimensioni possono essere trasportate così come sono come mono e disaccaridi.

Per quanto riguarda le fonti più complesse non si può avere un sistema di trasporto efficiente e quindi bisogna avere enzimi extra-cellulari che ne riducono le dimensioni. I microrganismi, quindi, devono anche essere dotati di proteasi e glicosidasi che riducono di dimensioni proteine e polisaccaridi esterni; i bifidobatteri del microbiota del latte materno devono essere dotati di enzimi glicosidasi esterni che riducono le dimensioni degli oligosaccaridi.

Per le proteine si devono avere delle proteasi, mentre le peptidasi intervengono dopo all’interno; il trasporto della fonte di azoto si dedica agli amminoacidi e peptidi di massimo 35-40 amminoacidi. Pensando al trasporto degli zuccheri, può avvenire con due sistemi principali: il sistema complesso PEP-PTS o permeasico, quindi, o si ha un’unica proteina di membrana permeasi che funziona in simporto, antiporto, uniporto o un sistema complesso con diverse fosfotransferasi che catturano il fosfato da un intermedio della glicolisi, ovvero il fosfo-enol-piruvato e poi lo portano all’interno della cellula.

Con questo sistema di gruppo lo zucchero entra fosforilato grazie al fosfato del P-enol-piruvato che è un intermedio della glicolisi; di queste fosfo-transferasi quella che ha un ruolo fondamentale perché interviene in un raffinato sistema di regolazione di quanto zucchero entra è HPr. Il trasporto e il catabolismo dello zucchero sono legati, non indipendenti e per portare dentro lo zucchero bisogna sfruttare un intermedio della glicolisi; questo suggerisce che questo sistema è fatto in modo di essere interconnesso con chi si occupa del catabolismo.

Utilizzando questo sistema di trasporto dove si ha il consumo di una molecola di fosfo-enol-piruvato, lo step della glicolisi è quello in cui si ottengono due molecole di ATP e quindi se si porta lo zucchero con questo meccanismo si ha un’efficienza uguale della glicolisi in quanto non cambia nulla in termini di bilancio energetico. Questi sistemi (glicolisi e trasporto) si parlano.

L’altro sistema che consente di portare all’interno le molecole è quello permeasico che è dotato di un’unica proteina che in alcuni microrganismi prevede il simporto con uno ione H+ e quindi un sistema di questo tipo non consuma subito energia; il consumo energetico si ha perché trasportando lo zucchero con un protone si altera il potenziale transmembrana (H+ fuori più elevato) ed è fondamentale che la differenza di potenziale rimanga nella membrana. Tutto ciò che interferisce con il mantenimento del differenziale uccide la cellula; ci sono molecole che legano gli H+ facendoli passare liberamente nella membrana e quindi sono molecole che portano all’inattivazione metabolica delle cellule. Trasportare in questo modo uno zucchero ha un costo energetico per portare fuori i protoni che può avvenire in due modi: se si ha una catena di trasporto degli elettroni con un metabolismo respirativo ogni volta che NADH ridotto scarica gli elettroni sulla catena i protoni escono all’esterno, mentre nei batteri anaerobi (lattici) l’unico sistema è utilizzare l’ATP sintasi in senso inverso consumando ATP e quindi il costo energetico di un trasporto permeasico diventa evidente.

Quando il protone e il lattosio si legano a siti della permeasi si ribalta all’interno della cellula dove si ha un pH diverso che è più alcalino facendo sì che i protoni si liberino del sito di legame e anche il lattosio. La cellula per regolare il modo in cui gli zuccheri entrano nella cellula deve trovare un modo per far entrare più velocemente le molecole quando la cellula ne ha bisogno per crescere, mentre quando la crescita si arresta bisogna rallentare l’ingresso dello zucchero; per fare questo, si può regolare l’espressione di alcuni geni in base all’accumulo di ATP.

Inoltre, se l’ATP è presente in elevate concentrazioni va a inibire la fosfo-frutto-chinasi che porta alla produzione di fruttosio-1,6-P, più ATP si forma e meno funziona questo enzima. Questa regolazione si a livello della glicolisi ma si deve rallentare anche l’ingresso dello zucchero inibendo i trasportatori di membrana.