RUN- ON
variazione del 30% della velocità: possiamo concludere che la variazione di accumulo
all'equilibrio è in parte dovuto alla variazione della velocità di sintesi. Ciò però non
garantisce che sia solo quella la regolazione alterata. Dobbiamo indagare sulle altre tappe
regolative.
Per quanto riguarda il vettore, il plasmide, non osserviamo alcuna ibridazione. Perché? Si
tratta di un controllo, il vettore vuoto, senza inserto che è stato depositato sui filtri. Usiamo
il puc -vettore come controllo, perché non deve dare segnale di ibridazione, per escludere
che i segnali siano dovuti alla presenza del vettore, quindi poiché non fornisce segnale,
saremo certi che sono dovuti solo al cDNA. 154
Lezione 22, biologia molecolare 25/11/2020
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Dopo aver saggiato la velocità di trascrizione del gene, oggetto di studio, bisogna capire se esiste qualche
altra tappa regolativa che è alterata. La quantificazione tramite northern blotting o RPA, vi è la tappa che
porta alla sintesi attraverso il nuclear run on, ora bisogna capire qual è il turn over di questo trascritto. Cioè
quanto velocemente o lentamente il trascritto viene degradato, nelle condizioni controllo e in quelle di
trattamento. Quindi, la condizione di trattamento viene messa sempre a confronto con il controllo. Per fare
ciò, bisogna mettere delle cellule in coltura, bisogna anche allestire una coltura primaria. Ad esempio, se
dobbiamo effettuare questa analisi negli epatociti, allestiremo una coltura primaria di epatociti oppure una
coltura di cellule stabilizzate (non sono cellule tumorali; hanno la capacità di proliferare, ma non sono
ancora cellule trasformate. Se avviene il processo di trasformazione diventano tumorali. Sono cellule che
possono essere acquistate). In ogni caso, dobbiamo seminare su piastra queste cellule e preparare diverse
piastre, perché ciò che andremo ad analizzare è l’Half life del trascritto, oggetto di studio.
Half life di mRNA per definire la sua stabilità.
L’Half life è il tempo di dimezzamento del trascritto. In questo caso, ciò che andremo a testare è l’Half life
chimico. Quindi, la capacità del trascritto di continuare ad ibridare con il suo stampo. Dunque, prepareremo
una serie di piastre e procederemo con il time course cioè monitoreremo nel tempo la quantità di trascritto,
per capire quando questo trascritto si degrada completamente. Allestiamo più piastre e definiamo i tempi a
cui queste piastre saranno processate.
Per esempio, possiamo allestire una piastra per il tempo 0, una per il tempo di 60 min, una per il tempo di
120 min, una per il tempo di 240 min ed una per il tempo di 300 min. A tempo 0, a tutte le piastre, viene
aggiunta l’actinomicina D in bassissime concentrazioni dell’ordine di pochi microgrammi per millilitro.
Actinomicina D.
Si può aggiungere o l’actinomicina D o l’α-amanitina. Queste due molecole sono inibitori dell’RNA
polimerasi II, il quale è l’enzima che sintetizza i messaggeri o i precursori dei messaggeri. Quindi, se
aggiungiamo actinomicina D o α-amanitina, la sintesi di tutti i messaggeri verrà inibita. A questo punto, se
processiamo una piastra per ogni tempo, da queste piastre estraiamo l’RNA totale, lo separiamo su gel di
agarosio denaturante e lo trasferiamo su filtro. Il filtro verrà ibridato con la sonda specifica, in questo caso il
cDNA del gene FAS, quindi, avremo nel tempo la quantificazione del trascritto per FAS oltre che del
trascritto controllo per la β-actina; perché il filtro sarà ibridato simultaneamente con la sonda per la βactina.
Avendo inibito la sintesi, tutto ciò che vedremo sarà relativo alla degradazione del trascritto, che nel tempo
ci permetterà di visualizzare una quantità sempre più ridotta di trascritto stesso. Quindi, a differenza di ciò
che vediamo all’equilibrio con un semplice northern blotting o RPA, con questo esperimento vedremo solo
la fase di degradazione, perché la sintesi è stata inibita. 155
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Esperimento.
Dopo che abbiamo caricato sul gel di agarosio in condizioni denaturanti a T=0; a T=60 min; a T=120 min; a
T=240 min; a T=300 min. Nel tempo otteniamo che il segnale sarà meno intenso perché si osserva una
degradazione del trascritto. Si procede con un’analisi densitometrica della lastra autoradiografica e poi si
inseriscono in un grafico i valori della densità ottica (D.O) rispetto al tempo.
Sul grafico si osserva una retta che intercetterà l’asse delle ascisse quando la densità ottica sarà paria a 0;
cioè, quando, dopo x minuti non ci sarà più trascritto. Il parametro da considerare è l’Half life, cioè il tempo
di dimezzamento. Quindi, se assumiamo che x (= valore in cui la retta intercetta l’asse delle ascisse) sia
uguale a 7 h, l’Half life sarà uguale a 3,5 h e si ottiene per interpolazione sulla retta dopo aver assunto che la
densità ottica debba essere uguale al 50%. La stessa cosa viene fatta per la β-actina.
Se, in questo caso, l’Half life è di 6 h vuol dire che le condizioni sperimentali utilizzate sono corrette. Inoltre,
dovremmo avere lo stesso tipo di Half life non solo nel controllo, ma anche nel trattato. Questo, per quanto 156
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riguarda la β-actina. Invece, è possibile che la retta per il gene FAS sia differente tra controllo e trattato. E’
possibile che il controllo abbia un tempo di dimezzamento superiore a quello del trattato.
I campioni per il controllo e per il trattato vengono caricati su gel o insieme o su due filtri differenti. Il
valore ottenuto nel FAS è valido solo se i valori ottenuti nella β-actina tra controllo e trattato sono
paragonabili, perché la β-actina non dovrebbe subire variazioni nel trattamento.
Quindi, se l’Half life della β-actina, nel controllo e nel trattato, è lo stesso, vuol dire che la variazione che noi
osserviamo nel gene FAS è reale.
La β-actina rappresenta sempre il nostro controllo interno.
Differential display.
E’ una tecnica che ha un valore storico e adesso si utilizza solo in alcune condizioni perché è stata sostituita
dal microarray, che viene sostituito dal sequenziamento a tappeto di tutti gli RNA con delle piattaforme di
sequenziamento. Questa tecnica si chiama differential display o screening differenziale dei trascritti. Questa
tecnica ci permette di identificare quali trascritti vengono sintetizzati in una situazione controllo rispetto ad
una situazione di trattamento. Quindi, ci permette di evidenziare quali sono i trascritti che fanno la
differenza fra due situazioni, fra cui una di controllo e una di trattamento.
Il primo passaggio da fare è costruire una genoteca di cDNA da una coltura cellulare, quindi, di mRNA
estratto da coltura cellulare chiamata linea (+). Dove, arbitrariamente, definiamo linea (+) la coltura
cellulare che dovrebbe presentare tutti i trascritti. Con questa genoteca, si seminano una serie di piastre e
avremo moltissimi cloni, per cui bisogna seminare tali cloni su più piastre. Da queste piastre si preparano i
filtri, mediante la tecnica di colony hybridization, cioè trasferimento di tutti i cloni su filtro. Questi filtri
verranno ibridati con cDNA radioattivo proveniente dalla linea (+) e cDNA radioattivo proveniente dalla linea
(-); dove per linea (-) intendiamo la coltura cellulare sottoposta a trattamento in cui ci dovrebbero essere
delle differenze di trascrizione.
Immaginiamo che tutta le genoteca sia stata seminata su un’unica piastra e da questa si preparano due filtri
in replica, che conterranno tutti i cloni presenti sulla piastra. Il primo filtro viene ibridato con cDNA marcato
proveniente dalla linea (+); il secondo filtro (= la replica), viene ibridato con il cDNA marcato proveniente
dalla linea (-). Abbiamo assunto che su questo filtro ci sono tutti i cloni della genoteca. Dopo l’ibridazione
effettuiamo l’autoradiografia, noteremo che il cDNA marcato della linea (+) va ad ibridare con tutti i cloni
presenti sul filtro perché corrispindono a sé stessi. Invece, nell’ibridazione del filtro con la linea (-)
mancheranno dei cloni che non ibridano perché manca il trascritto nella linea (-), quindi, il clone non può
ibridare. Quelli che mancano sono proprio i cloni che fanno la differenza. Per capire quali sono i trascritti
che mancano dobbiamo fare un confronto con l’ibridazione di tutti i cloni con il cDNA della linea (+).
Dunque, per esclusione identificheremo i cloni che fanno la differenza, quei trascritti che sono presenti nella
linea (+), ma che vengono a mancare nella linea (-). 157
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A questo punto si recupera dalla piastra madre il clone che è presene nell’ibridazione con il cDNA (+), ma è
assente nell’ibridazione con il cDNA (-) e si caratterizza. Questo clone o quei cloni sono quelli che
corrispondono ai trascritti che fanno la differenza, che non sono espressi a seguito del trattamento Banca
cDNA per sottrazione.
Un’altra tecnica che serve a fare un’analisi differenziale di trascritti è detta costruzione di una banca di cDNA
per sottrazione. Si parte sempre da una linea (+) e da una linea (-), quest’ultima è stata sottoposta ad uno
specifico trattamento. Isoliamo tutti i trascritti (o pool dei messaggeri, che solitamente sono poli-A, perché
quasi tutti i messaggeri hanno la coda di poli-A) e sintetizziamo su questo pool di messaggeri poli-A+ il cDNA
corrispondente. In realtà, effettuiamo la sintesi solo sui messaggeri poli-A+ provenienti dalla linea (+).
Quindi, sintetizziamo i cDNA corrispondenti a tutti i trascritti della linea (+). Questo cDNA viene messo ad
ibridare con tutti i trascritti provenienti dalla linea (-). Essendo lo stesso tipo di cellule, in teoria, ogni
trascritto della linea (-) dovrebbe trovare il corrispondente cDNA. Tuttavia, sappiamo che nella linea (-)
alcuni RNA non sono sintetizzati, dunque, non tutti i cDNA della linea (+) trovano da appaiarsi con i trascritti
provenienti dalla linea (-). Alcuni cDNA rimarranno non appaiati, cioè rimarranno a singolo filamento. A
questo punto, è possibile recuperare questi cDNA a singolo filamento separando i prodotti dell’ibridazione
mediante una cromatografia di idrossiapatite, che ci permetti di separare i duplex dai singoli filamenti. I
cDNA a singolo filamento, dopo essere stati isolati, vengono replicati e diventano duplex e con essi si
costruisce una piccola banca di cDNA. Questa banca viene definita banca di cDNA per sottrazione, perché
rappresenterà tutti quei cDNA che hanno fatto la differenza cioè che corrispondono a trascritti che sono
presenti nella linea (+), m
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