Biologia molecolare

Biologia molecolare

La biologia molecolare è una branca della biochimica che studia gli esseri viventi a livello dei meccanismi molecolari alla base della loro fisiologia, concentrandosi in particolare sulle interazioni tra le macromolecole, ovvero proteine e acidi nucleici (DNA e RNA).

Macromolecole

Le macromolecole più importanti per la biologia molecolare sono gli acidi nucleici (DNA, RNA) e le proteine; queste due famiglie di macromolecole sono strettamente correlate secondo il dogma della biologia molecolare, secondo cui il flusso dell’informazione genetica parte dal DNA e passa attraverso l’RNA per arrivare poi alle proteine. Questo dogma però è anche stato messo in discussione perché è stato scoperto che l’informazione può anche fluire al contrario dall’RNA al DNA (scoperta dei retrovirus). Gli acidi nucleici dettano la struttura delle proteine, ma non è mai vero il contrario.

Acidi nucleici

Sono polimeri lineari e mai ramificati i cui monomeri si chiamano nucleotidi (ribonucleotidi o desossiribonucleotidi), costituiti da tre porzioni fondamentali: la struttura centrale e portante è uno zucchero (ribosio o 2-desossiribosio) a cui sono legati da un lato le basi azotate e dall’altro un gruppo fosfato, attaccato C’ dello zucchero (possono esserne presenti fino ad un massimo di tre).

Le basi azotate si dividono in purine (adenina, guanina) e pirimidine (timina, citosina e uracile); U si trova solo nell’RNA mentre T si trova solo nel DNA ed è la versione metilata di U, mentre C è la versione con un gruppo amminico di U. Nel DNA troviamo solo A, G, C, T mentre nell’RNA troviamo A, G, C, U. Un nucleoside è composto solo dallo zucchero e dalla base azotata; sono (desossi-)adenosina, guanosina, citidina, timidina e uridina. Esistono anche le versioni dei nucleotidi con più di un gruppo fosfato (AMP, ADP, ATP, GMP, GDP, GTP…).

Ciò che mantiene uniti i vari nucleotidi nella formazione del polimero di acido nucleico è il legame fosfodiesterico (atomo di fosforo che forma legame estere con il carbonio in 5’ e quello in 3’ del nucleotide precedente). Per questo motivo nella catena di acido nucleico si riconoscono un’estremità 3’ e un’estremità 5’.

DNA

All’interno delle cellule il DNA è sempre formato da due catene polinucleotidiche che si appaiano insieme a formare la classica struttura a doppia elica del DNA; in particolare le basi che si appaiano lo fanno sempre secondo la regola della complementarietà delle basi (una purina più grande con una pirimidina più piccola): A-T e G-C, in particolare A=T sono unite da due legami idrogeno mentre C≡G sono unite da tre legami idrogeno. Una base più ingombrante si lega sempre con una meno ingombrante, e questo fa sì che la distanza tra gli zuccheri delle due eliche sia mantenuta costante.

La doppia elica non ha però una spaziatura regolare, sono presenti un solco maggiore e un solco minore alternati, struttura dovuta al fatto che i due backbones non sono perfettamente paralleli tra loro bensì sono un po’ angolari, quindi si avrà una zona più stretta che costituirà il solco minore ed una che costituirà il solco maggiore. In pratica questi solchi sono dovuti ai gruppi che sporgono dalle molecole dei nucleotidi. Nel solco maggiore è molto più semplice infatti riconoscere le basi perché i gruppi chimici esposti sono più numerosi.

Le due molecole di DNA si appaiano inoltre tra di loro in modo antiparallelo; la doppia elica inoltre nel B-DNA ha un andamento destrorso (le due eliche si avvolgono l’una sull’altra in senso orario), anche se esistono eliche che si avvolgono in senso sinistrorso.

Il DNA si può trovare sotto diverse forme, la principale è quella del B-DNA (la struttura Watson e Crick), destrorsa, che è quella che si stima sia presente in maggiore quantità nelle cellule, caratterizzata da un passo di 3,4 nm dato da 10 coppie di basi. C’è poi la forma ad A-DNA che è destrorsa e più schiacciata rispetto al B-DNA, ha spessore maggiore e 11 nucleotidi per giro; si può trovare in alcune condizioni ad esempio nell’appaiamento RNA-DNA o RNA-DNA, oppure in condizioni di bassa umidità (in vitro). La forma Z-DNA invece è un’elica sinistrorsa, anche se l’appaiamento tra basi è sempre A-T e G-C; essa si può trovare in regioni particolarmente G-C ricche.

L’ultima struttura del DNA possibile è quella a tripla elica, molto fitta e con andamento destrorso, che si può verificare in vitro o in situazioni in cui si ha ricombinazione o riparazione del DNA, è tuttavia una condizione solo transitoria, non è infatti stabile. Le basi che si alternano nella struttura del DNA tra loro possono fare degli spostamenti, che influiscono sulla conformazione generale della doppia elica: rotazione lungo l’asse x delle basi (roll), spostamento lungo l’asse x (slide), rotazione lungo l’asse y (twist); per questo motivo la molecola di DNA a doppia elica può non solo avere diverse conformazioni ma può anche subire delle pieghe, torsioni o curve: è una molecola estremamente flessibile.

Le due eliche del DNA inoltre possono essere separate in maniera reversibile: il DNA può essere denaturato, e questa possibilità è fondamentale per tutti i processi in cui è coinvolto il DNA che richiedono la separazione delle due eliche. Per ottenere una denaturazione è necessario introdurre energia, in quanto i legami idrogeno tra le basi non sono deboli ma essendo tanti creano un’interazione piuttosto forte, quindi è necessaria energia per romperli e separare i due filamenti; questo in vivo avviene ad opera di enzimi mentre in vitro è necessario fornire calore e alcali (basi). A differenza delle proteine, che vengono denaturate in modo irreversibile, il DNA può essere rinaturato, ripristinando le condizioni iniziali (in vitro pH neutro e raffreddamento): siccome le basi sono complementari facilmente si ritrovano spontaneamente e si riappaiano.

Effetto ipercromico: la doppia elica di DNA assorbe meno luce rispetto alle singole eliche di polinucleotidi; questo permette attraverso la misurazione dell’assorbanza di seguire il processo di denaturazione del DNA in modo graduale. Molecole di DNA diverse hanno delle temperature t di denaturazione diverse, e questo è influenzato dal contenuto in G-C: all’aumentare del contenuto di coppie G-C aumenta la temperatura t di denaturazione.

Esistono anche molecole di DNA circolari, presenti ad esempio nei procarioti; anche queste possono essere denaturate, ma in questo caso le due eliche non riescono a separarsi ed allontanarsi, bensì rimarranno attorcigliate l’una attorno all’altra, non è possibile districarle dopo averle denaturate; esiste un parametro detto numero di legame che indica quante volte una molecola è attorcigliata attorno all’altra.

RNA

L’RNA differisce dal DNA perché possiede il ribosio, uno zucchero con un gruppo ossidrilico in 2’, cosa che lo rende molto più instabile rispetto al DNA e molto più aggredibile da alcali. L’uracile si trova al posto della timina, ma il tipo di appaiamento è lo stesso: nell’RNA troviamo infatti U-A. L’RNA non si presenta in natura sotto forma di doppia elica, però si possono formare degli appaiamenti tra basi intramolecolari (all’interno dello stesso filamento), che danno origine a delle strutture particolari: la struttura secondaria che può essere stem-loop con un fusto (parte con appaiamento) e un’ansa (porzione dove le basi non appaiano perché non c’è complementarietà) oppure forcina, che presenta un’ansa di non appaiamento molto piccola; si può avere anche una struttura terziaria, molto complessa e data da più appaiamenti.

Proteine

Le proteine sono anch’esse polimeri lineari a cui possono poi essere attaccati diversi gruppi chimici per formare delle ramificazioni; i monomeri che costituiscono le proteine sono gli amminoacidi, che hanno tutti la stessa struttura generale e differiscono per la catena laterale R detta anche residuo amminoacidico. Esistono 20 diversi tipi di catena laterale R, che determinano quindi la presenza di 20 diversi tipi di amminoacidi; questi 20 possono essere raggruppati in famiglie con proprietà simili.

Gli amminoacidi basici sono lisina, arginina ed istidina, quelli acidi sono acido aspartico e acido glutammico, ci sono poi gli amminoacidi polari che sono serina, treonina, asparagina e glutammina e gli amminoacidi idrofobici, che sono alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, tirosina e triptofano. Alcuni amminoacidi speciali infine sono cisteina (ponti disolfuro), glicina (la catena R è un idrogeno) e prolina (in grado di interrompere la struttura secondaria delle proteine). Queste proprietà degli amminoacidi sono importanti nel determinare la struttura delle proteine.

I vari amminoacidi sono uniti tra loro a formare una proteina mediante legame peptidico, il gruppo amminico di un amminoacido reagisce con quello carbossilico di un altro e si ha la liberazione di una molecola d’acqua. Anche nelle proteine sono presenti due estremità diverse, una N-terminale e una C-terminale (si scrive per prima quella N-terminale). Si possono distinguere poi degli oligopeptidi (polimeri di pochi amminoacidi) e polipeptidi (proteine vere e proprie, polimeri di tanti amminoacidi).

Le proteine presentano 4 diversi livelli strutturali:

• Struttura primaria: è semplicemente la sequenza amminoacidica della proteina; per indicarla si utilizzano codici a tre lettere (Arg, Leu, Met) o codici ad una lettera (R, L, M) in cui però le lettere non rappresentano sempre le iniziali dell’amminoacido.
• Struttura secondaria: dettata dalla sequenza primaria, sono strutture assunte da brevi tratti di proteine che si ripetono; troviamo la struttura ad α-elica in cui si formano legami idrogeno tra un amminoacido e il quarto amminoacido successivo, questa struttura può formarsi solo se la composizione in amminoacidi della proteina lo permette, inoltre questa struttura è facilitata o impedita dalla natura delle catene laterali R degli amminoacidi dell’α-elica, che sporgono lateralmente, ad esempio la prolina ha un gruppo laterale incompatibile con la formazione di α-elica (passo di 3,6 residui per giro). In genere α-eliche diverse anche all’interno della stessa proteina hanno la tendenza ad interagire tra di loro: sono le α-eliche anfipatiche, cioè formate da due superfici diverse, una idrofobica e una idrofilica; le superfici idrofobiche tendono ad interagire tra loro formando strutture più complesse. L’altra struttura secondaria possibile per le proteine è la struttura a β-foglietto, dovuta sempre ad interazioni idrogeno tra le porzioni amminoterminali e carbossiterminali, però in questo caso tra amminoacidi di due filamenti diversi; i due filamenti possono essere appaiati parallelamente o antiparallelamente. Nella simbologia le α-eliche si indicano con un cilindro mentre i β-foglietti si indicano con delle frecce.
• Struttura terziaria: costituiscono i cosiddetti motivi strutturali delle proteine, ovvero zone di proteine presenti anche in proteine diverse che però assumono delle strutture secondarie e terziarie caratteristiche (es. coiled coil, tipica delle zone di proteine che permettono la dimerizzazione di proteine, unione stabile di due proteine diverse); la struttura coiled coil è dovuta alla presenza di zone idrofobiche che interagiscono tra di loro in proteine diverse. Un altro motivo strutturale è l’helix-loop-helix, e lo zinc-finger.
• Struttura quaternaria: data dall’interazione di 4 proteine diverse, come nel caso dell’emoglobina.

Il folding è un processo di ripiegamento molecolare attraverso il quale le proteine ottengono la loro struttura tridimensionale: le proteine hanno un loro ripiegamento, detto folding, la loro struttura terziaria, che determina anche la struttura quaternaria; può essere ottenuto ad esempio con la presenza di ponti disolfuro. Il ripiegamento quindi è dovuto alla struttura primaria e a quella secondaria.

La replicazione del DNA

Modello di Watson e Crick

Watson e Crick avevano già intuito come potesse avvenire il meccanismo di replicazione, in base alla struttura del DNA; avevano capito infatti che separando le due eliche di DNA era possibile utilizzarle come stampo basandosi sul concetto della complementarietà delle due eliche. Erano ipotizzati tre modelli, un modello conservativo, uno dispersivo ed uno semiconservativo. Secondo il modello conservativo, la replicazione avveniva a partire dalla parentale e il risultato finale erano due eliche, una completamente di neosintesi ed una completamente parentale; secondo il modello semiconservativo invece i due filamenti della doppia elica si separano e ciascuno fa da stampo, in modo da ottenere due eliche con un filamento parentale ed uno di neosintesi. Il modello dispersivo invece prevede che la doppia elica di neosintesi sia fatta da alcune porzioni parentali e alcune di neosintesi.

Per capire quale fosse il modello realistico, Meselson e Stahl effettuarono un esperimento: utilizzarono degli isotopi dell’azoto, il ¹⁴N e il ¹⁵N (più pesante), e fecero crescere dei batteriofagi in terreni addizionati di ¹⁵N, dopo un certo numero di replicazioni il DNA di questi batteriofagi sarà costituito esclusivamente da ¹⁵N e sarà perciò pesante (DNA marcato con ¹⁵N). Questi batteri sono stati poi posti in un terreno addizionato soltanto di ¹⁴N e sono stati fatti replicare per un solo ciclo replicativo: in questo modo, il DNA neosintetizzato sarà costituito esclusivamente da ¹⁴N mentre quello parentale sarà costituito ancora da ¹⁵N. In questo modo, dopo un ciclo replicativo hanno pesato il DNA delle generazioni ¹⁴N-¹⁴N, ¹⁵N-¹⁵N e ¹⁴N-¹⁵N con delle tecniche di centrifugazione in gradiente di densità con CsCl (sale pesante, che tende a stratificarsi all’interno della provetta quando viene applicata una forza centrifuga): si crea un gradiente continuo all’interno della provetta, in basso la densità è maggiore mentre verso l’alto diminuisce. Grazie a questo gradiente di cloruro di cesio, il DNA andrà a stratificarsi all’interno di questo gradiente in una zona con densità uguale alla propria: più sarà pesante, più la banda si formerà verso il basso. Quindi il DNA ¹⁴N-¹⁴N andrà in alto, ¹⁵N-¹⁵N andrà in basso e ¹⁴N-¹⁵N andrà in una posizione intermedia tra i due.

Siccome il DNA della F1 si era posizionato in una posizione intermedia, il modello conservativo poteva essere escluso: se infatti il modello conservativo fosse quello reale, si sarebbero formate due bande, una ¹⁴N-¹⁴N e una ¹⁵N-¹⁵N. Non si può tuttavia escludere il modello dispersivo, perché anche in questo caso si formerebbe una banda intermedia, come per il modello conservativo. Per escludere il modello dispersivo era necessario andare avanti con le generazioni: così facendo si noterà una quantità di bande leggere simile a quella di bande miste, e nessuna banda pesante. Questo esperimento dimostra definitivamente che il modello veritiero per la replicazione è quello semiconservativo.

La replicazione del DNA: punto di origine

Lo step successivo era capire da dove cominciasse la replicazione. Si ha la formazione di una bolla di replicazione, ma era necessario capire in quale direzione procedesse la replicazione. Fu utilizzata della timidina costituita da ³H per crescere dei batteri, dopodiché gli stessi vengono fatti crescere in timidina normale. Se la replicazione procedesse in modo unidirezionale nella bolla si creerebbe una sorta di gradiente di radioattività alternato; nel caso in cui le bolle di replicazione procedessero in modo bidirezionale si avrà la zona centrale della bolla molto radioattiva mentre le zone marginali saranno meno radioattive. Il risultato è che si ottengono zone centrali più radioattive fiancheggiate da zone a gradiente meno radioattive: questo corrisponde al modello di replicazione bidirezionale all’interno nella bolla. C’è quindi un punto di origine di replicazione in cui si forma la bolla, poi la bolla si allarga in modo bidirezionale, quindi la replicazione a partire da un punto interno alla molecola procede in modo bidirezionale.

Un altro esperimento che può essere effettuato è prendere il cromosoma batterico normalmente in forma circolare e renderlo lineare, e poi osservare al microscopio ciò che accade in tempi successivi: si osserverà la formazione di una bolla di replicazione molto piccola, che si allargherà sempre più in entrambe le direzioni.

In Escherichia coli, modello per organismi procariotici, esiste una zona chiamata oriC da cui ha sempre origine la replicazione, una zona di circa 240 bp che contiene delle sequenze ripetute; per gli organismi eucariotici invece il modello è Saccharomyces cerevisiae, organismo unicellulare che possiede delle origini di replicazione chiamate ARS (autonomously replicating sequence) di 180 bp, si tratta di sequenze che sono in grado di generare origine della replicazione. Queste sequenze ARS sono state paragonate ed è stata riconosciuta una sequenza consenso, A-T ricca, data solitamente da (A/T)TTTAT(A/G)TTT(A/T), è una sequenza ricorrente. Un altro organismo è SV40 (Simian virus 40) in grado di infettare primati; è stato utile per studiare le origini di replicazione degli organismi più complessi grazie al fatto che ha una sua origine di replicazione che dev’essere usata per replicare.

All’interno di oriC di Escherichia coli sono presenti delle zone ripetute dette tredicimeri, perché dati da 13 bp; si tratta di sequenze A-T ricche. Inoltre sono presenti anche dei nonameri, anche se con alcune variazioni sono 9 bp che si ripetono in modo abbastanza simile.