Biologia molecolare

Regolazione della terminazione della trascrizione

Successivamente nel corso dell'infezione, la terminazione di P e P non funziona più, ovvero si ottengono trascritti più lunghi. Quindi c'è una regolazione: nelle fasi iniziali dell'infezione c'è terminazione, nelle fasi avanzate no. In provetta si è visto che la terminazione non si presenta mai, si ottengono solo trascritti lunghi, questo fa capire che in provetta mancherebbe un componente, che possa innescare il processo di terminazione: la proteina Rho, una proteina esamerica (elicasi) attorno alla quale si legano 70-80bp dell'mRNA. Rho non è una proteina fagica, è una proteina batterica, e si sposta lungo la molecola di RNA mediante idrolisi di ATP finché non separa le due eliche dell'ibrido DNA-RNA (attività elicasica). La capacità di Rho di indurre la terminazione dipende dalla sua velocità di spostamento lungo l'mRNA rispetto a quella dell'RNA polimerasi.

Sono presenti 3 RNA polimerasi, quindi la terminazione dev'essere regolata in modi diversi. Per la polimerasi II, la trascrizione di solito termina 0.5-2 kb dopo il sito di poliadenilazione; il processo di trascrizione in questo caso è accoppiato quindi alla poliadenilazione. La RNA polimerasi III termina dopo aver sintetizzato una serie di U, ma non richiede strutture stem-loop (si basa sul legame debole tra templato e filamento di neosintesi dovuto agli appaiamenti U=A, che causa il distacco dell'RNA polimerasi III). L'RNA polimerasi I invece termina per via della presenza di sequenze T1 e T2; un fattore polimerasi-specifico, TTF1, lega il DNA a valle dell'unità trascrizionale. Endonucleasi Rat1 taglia il trascritto in corrispondenza di una zona a valle di questi due segnali, staccando il trascritto dalla RNA polimerasi. Negli eucarioti esiste una antiterminazione, basati su un sistema virale: il virus HIV (Human Immunodeficiency Virus) è un retrovirus.

E il suo genoma viene retrotrascritto, ovvero copiato su DNA e poi integrato nel genoma della cellula ospite. Si è scoperta una proteina codificata da una certa regione del genoma dell'HIV, la proteina tat, che funziona come molecola di antiterminazione, ha una sua sequenza di riconoscimento sul genoma di HIV che si trova in 5' e si chiama TAR. Per produrre nuove particelle virali, il genoma virale dev'essere trascritto interamente, quindi il genoma dell'HIV si servirà di tat per poter estendere e sintetizzare completamente il proprio genoma a RNA. La sequenza TAR è una sequenza bipartita, data da una zona che lega tat e una zona che lega la ciclina T; la ciclina T forma un complesso con Cdk9, complesso detto pTEFb, complesso di estensione. Si crea un complesso con pTEFb e altre proteine con l'RNA polimerasi, la Cdk9 va a fosforilare la coda C-terminale della RNA polimerasi II (CTD), rendendola processiva: quindi il meccanismo è quello.

Di rendere più processiva la RNA polimerasi II stimolandone l'attività.

La maturazione degli RNA messaggeri negli eucarioti.

I trascritti eucariotici neosintetizzati sono immaturi, solitamente più lunghi rispetto al trascritto finale che sarà poi tradotto, quindi la maturazione richiede anche un accorciamento dell'RNA messaggero. La maturazione richiede 3 tappe principali:

1. Capping in 5' → appena la polimerasi inizia a sintetizzare l'mRNA, quando quindi è ancora corto (25-30 nt) l'estremità 5' viene modificata, gli viene attaccata una 7-metilguanosina mediante un legame particolare. Questo legame avviene grazie ad enzimi che viaggiano assieme alla RNA polimerasi perché sono legati al CTD fosforilato (il CTD è una sorta di hub). La 7-metilguanosina è un nucleotide che viene attaccato con un legame testa-testa tra nucleotidi (legame 5'-5'), è come se il nucleotide venisse

attaccato al contrario, ed è un nucleotide che dovrà poi essere metilato in posizione 7; si parte dal primo nucleotide dell'mRNA, che è un nucleotide trifosfato in 5' (gruppi fosfato detti α, β e γ) e per far formare questo legame, quest'estremità coi gruppi fosfato del primo nucleotide dell'mRNA dev'essere attivata: l'enzima RNA trifosfatasi (attaccata al CTD dell'RNApolimerasi) stacca il fosfato γ del nucleotide in 5' rendendolo reattivo, poi interviene una guanililtransferasi che formerà il legame fosfotriesterico. Successivamente, interviene una metiltransferasi che utilizza come donatore di gruppo metilico la S-adenosilmetionina (SAM) e lo attacca in posizione 7. Interverranno inoltre in seguito delle altre metiltransferasi (esistono molti tipi di capping), che metileranno anche il primo nucleotide a cui è attaccato il cappuccio. Possono formarsi diversi cappucci: Cap0 → lievito,

lefunzioni; con alcune tecniche di purificazione è possibile isolare gli mRNA con queste proteine attaccate, macosì facendo non è garantito che le proteine rimangano attaccate all'mRNA, quindi si utilizza il cross-linking: si fa in modo che le proteine vengano legate covalentemente all'mRNA e quindi non si possano staccare se non con manipolazione svolte successivamente. In questo caso la "colla" sono le radiazioni UV,che inducono la reazione di gruppi chimici proteici con gruppi chimici dei nucleotidi dell'mRNA, causandola formazione di legami covalenti tra la molecola di RNA e le proteine ad essa associate. Tutte le estremità degli mRNA della cellula presentano una lunga coda poliA, che ha affinità con una lunga coda di T e creareun appaiamento; basterà prendere quindi una resina cromatografica (cromatografia per affinità) cosicché tutte le molecole con una coda poliA (quindi tutti i mRNA) si

attaccheranno alla resina, e dopo potranno essere eluite: a questo punto l'eluato presenterà mRNA cross-linkati alle proteine legate agli mRNA. In questo modo si sono potute analizzare queste hnRNP, e si è scoperto che sono proteine modulari che presentano uno o più domini di legame all'RNA e uno o più domini di interazione con altre proteine; in particolare come domini di interazione presentano spesso il motivo RNP o RBD (RNA binding domain), un dominio di circa 80 amminoacidi, contiene due regioni evolutivamente conservate, RNP1 e RNP2 formano una superficie carica positivamente in grado di attrarre l'mRNA (che essendo un acido nucleico è carico negativamente). Altri motivi di legame delle hnRNP sono i RGG box (Arg-Gly-Gly), dato dalla ripetizione di questi tre amminoacidi, i RGG box sono tipici della proteina N e della proteina Tat dell'HIV. Un altro motivo, tipico della proteina K (una hnRNP), è il motivo KH dato da 45 amminoacidi.

simile a RBD ma più piccolo, dato da 3 β-foglietti con due α-eliche che forma una superficie idrofobica composta dalle α-eliche più un β-foglietto. Altre proteine scortano gli RNA attraverso il poro nucleare e vengono riciclate nel citoplasma.

2. Taglio in 3' e poliadenilazione → tutti mRNA della cellula presentano questa coda poliA, di lunghezze diverse; nonostante questo c'è una classe di proteine che viene trascritta da mRNAs provvisti di questa coda poliA, ovvero i mRNA che codificano per istoni, tutti gli altri mRNA però presentano la coda poliA. La coda poliA in 3' non è codificata dal genoma, quindi non è una sorta di terminatore o qualcosa del genere scritto sul DNA, bensì viene attaccata dopo: solitamente infatti i mRNA eucariotici sono molto più lunghi del prodotto finale, perché viene trascritta una sequenza più lunga che dopo viene rimossa. Esistono sull'mRNA dei