Biologia molecolare

BIOLOGIA CELLULARE (continuo degli appunti del quaderno)

1. GENOMI (capitolo 5 delle slide)

Lo studio di struttura e organizzazione dei genomi ha fatto in questi decenni 2 SALTI

QUALITATIVI stimolati dalle nuove metodologie di analisi dei genomi.

Negli ANNI ‘60 si poteva solo analizzare il DNA TOTALE preparato da cellule/tessuti ottenendo

informazioni generiche.

Un importante salto qualitativo è stato possibile, a partire dal 1975, con la possibilità di

CLONARE (isolare) FRAMMENTI “piccoli di DNA” e analizzarne la sequenza nucleotidica.

IL 1975 è L’ERA DELL’INIZIO DEL CLONAGGIO.

1995 è INIZIA L’ERA GENOMICA. (Genomi procariotici, Genomi eucariotici, Genoma

mitocondriale, Genoma dei cloroplasti, Genoma dei virus.)

Gli studi biomolecolari hanno così assunto una dimensione ‘OMICA’, suffisso utilizzato in

molti ambiti, sta a rappresentare la dimensione di scala dell’indagine, relativa all’intero

complesso delle unità elementari di un dato sistema.

CONSERVAZIONE EVOLUTIVA E FUNZIONE BIOLOGICA: studi di genomica comparata ci

Gli

permettono di confrontare i geni e le sequenze genetiche tra diverse specie. Quando una

sequenza genetica o una struttura viene conservata (cioè rimane invariata) nel corso di milioni

di anni e tra specie diverse, ciò suggerisce che ha una funzione essenziale. Questo perché la

selezione naturale tende a preservare le caratteristiche che sono fondamentali per la

sopravvivenza o la riproduzione degli organismi. Ad esempio, se una proteina specifica si trova

sia nei batteri che negli esseri umani, è probabile che svolga un ruolo biologico critico condiviso

da molte forme di vita.

. GENOMI PROCARIOTI

I procarioti sono organismi UNICELLULARI MISCROSCOPICI diffusi in ogni ambiente.

Sebbene ne siano conosciute migliaia di specie, si stima che ne esistano centinaia di migliaia,

se non milioni.

Il concetto di specie nei batteri è considerato arbitrario, poiché non segue le stesse regole

utilizzate per gli organismi più complessi.

La loro classificazione si basa principalmente sull’analisi filogenetica dell’rRNA 16S,

integrata con altri caratteri come la morfologia e le proprietà biochimiche.

IL GENOMA DEI PROCARIOTI è generalmente costituito da UN SINGOLO CROMOSOMA

CIRCOLARE che contiene una molecola di DNA lunga milioni di coppie di basi (bp).

Tuttavia, esistono importanti eccezioni a questa struttura, ad esempio alcuni batteri hanno

genomi di forma lineare o multipli cromosomi.

Esempi di eccezioni:

• Borrelia burgdorferi (agente della malattia di Lyme) possiede un genoma lineare di

circa 0,9 Mpb, con telomeri costituiti da forcine chiuse covalentemente, e 21 plasmidi

di forma sia lineare che circolare.

• Vibrio cholerae (causa del colera) presenta due cromosomi circolari.

• Rhizobium meliloti, batterio simbiotico di alcune piante leguminose, possiede tre

cromosomi circolari.

I genomi batterici sono estremamente variabili nelle dimensioni, con valori che vanno da 144

kpb a 13.000 kpb.

Questa variabilità si accompagna a una notevole PLASTICITA’ GENOMICA che permette grandi

differenze anche tra individui della stessa specie.

In questo contesto si distinguono due componenti del genoma batterico:

• Endogenoma -> cioè la parte genomica comune a tutti i ceppi di una specie.

• Frazione variabile -> che differisce significativamente tra ceppi diversi.

Ad esempio, i genomi di E. coli sequenziati finora mostrano una dimensione compresa tra 4,6 e

5,5 Mpb.

Un caso interessante è quello di Haemophilus influenzale, un batterio Gram-negativo di cui

l'uomo è l'unico ospite.

Sebbene il nome possa indurre in errore, non ha alcuna relazione con l'influenza, che è causata

da virus.

Questo batterio esiste in due forme principali: con capsula esterna (sei tipi, da a a f) e senza

capsula.

Prima dell'introduzione del vaccino coniugato contro il tipo b (Hib), il ceppo capsulato di tipo b

era il principale responsabile di gravi infezioni invasive nei bambini, come meningite e altre

malattie diffuse a più organi.

Oggi, nonostante il vaccino, H. influenzale può ancora causare malattie respiratorie come otiti

e bronchiti, nonché infezioni più gravi quali sepsi, polmonite e meningite.

TRASFERIMENTO GENICO ORIZZONTALE

I procarioti hanno una straordinaria capacità di scambio genetico, nota come trasferimento

genico orizzontale. Questo avviene attraverso tre principali meccanismi:

1.TRASFORMAZIONE: Il batterio riceve DNA esogeno dall'ambiente circostante, se reso

"competente" per questo processo. Un esempio classico è l'esperimento di Griffith, che

dimostrò come il DNA possa essere trasferito tra batteri, causando la trasformazione di un

ceppo non patogeno in uno patogeno.

2.TRASDUZIONE: In questo caso, il trasferimento genetico avviene grazie a un fago (virus

batterico) che trasporta frammenti di DNA da un batterio all'altro.

3.CONIUGAZIONE: Questo meccanismo richiede il contatto diretto tra due cellule ed è

facilitato da plasmidi coniugativi, che permettono il passaggio del DNA da una cellula donatrice

a una ricevente.

Questi eventi di trasferimento genico possono conferire ai batteri nuove proprietà, come la

resistenza agli antibiotici o specifiche caratteristiche di virulenza. Le regioni genomiche che

contengono geni associati a proprietà patogene, come quelle che conferiscono la capacità di

invadere un organismo ospite sono spesso identificate come isole di patogenicità. Queste

regioni mostrano un contenuto di G+C atipico rispetto al resto del genoma.

CARATTERISTICHE DEL GENOMA E DEI GENI NEI PROCARIOTI:

GENI SENZA INTRONI: Nei procarioti, i geni generalmente non contengono introni, il che rende

la loro trascrizione e traduzione più rapide rispetto agli eucarioti.

ALTA DENSITÀ GENICA: I genomi procariotici hanno una densità genica molto elevata, con una

minima quantità di DNA non codificante, che rende il genoma più compatto.

ORGANIZZAZIONE IN UNITA' TRASCRIZIONALI POLICISTRONICHE: I genomi sono

frequentemente organizzati in unità trascrizionali policistroniche, cioè più geni vengono

trascritti insieme come un singolo mRNA. Ciò significa che lo stesso promotore può controllare

l'espressione di più geni funzionalmente correlati, ottimizzando l'uso delle risorse genetiche e

riducendo le regioni regolatorie.

85% DEL GENOMA OCCUPATO DA GENI CODIFICANTI: In media, l'85% del genoma

procariotico è occupato da geni codificanti per proteine (con una lunghezza media di circa 300

amminoacidi). Solo il restante 15% è costituito da DNA non codificante, che include anche geni

per RNA regolatori, come rRNA e tRNA.

COMPOSIZIONE G-C: La composizione in GC% dei genomi procariotici varia tra il 25% e il 75%.

Il contenuto di G-C influenza la stabilità del DNA e può essere correlato a diversi ambienti

ecologici in cui i batteri si trovano.

VARIAZIONE DEL NUMERO DEI GENI E DIMENSIONI DEL GENOMA:

1.Parassiti specializzati: I batteri parassiti tendono ad avere un numero ridotto di geni, con

alcune specie che ne possiedono solo alcune centinaia.

2.Batteri generalisti: I batteri che vivono in ambienti più variabili e che devono affrontare

diverse sfide ecologiche hanno genomi più grandi, con migliaia di geni (tra 4000 e 5000).

3.Plasticità del genoma: I genomi procariotici mostrano una grande plasticità, cioè l'ordine dei

geni può variare significativamente tra specie e gruppi tassonomici differenti. Inoltre, gruppi di

geni che sono contenuti nello stesso operone in una specie possono essere dispersi in altre

specie.

GENOMI ARCHEOBACTERI:

Il numero di geni negli archeobatteri è meno variabile rispetto agli eubatteri e generalmente

varia tra 1700 e 2900.

Le dimensioni dei genomi degli archeobatteri sono relativamente costanti, tra 1,5 e 2,5 Mbp.

Gli archeobatteri, che vivono in ambienti estremi, presentano alcune caratteristiche che li

differenziano dagli eubatteri:

1.Proteine informazionali: Le proteine implicate in replicazione, trascrizione e traduzione sono

più simili a quelle degli eucarioti. Ad esempio, l'RNA polimerasi degli archeobatteri è

strutturalmente simile alla RNA pol II degli eucarioti.

2.Presenza di istoni: Gli archeobatteri possiedono proteine simili agli istoni, che negli eucarioti

sono coinvolte nel ripiegamento del DNA.

3.Promotori simili agli eucarioti: La struttura del promotore negli archeobatteri è simile a

quella degli eucarioti, con una TATA box situata a circa 30 pb prima del sito di inizio trascrizione

(negli eubatteri, la TATA box si trova a circa 10 pb prima).

4.Inizio della traduzione con Metionina: A differenza degli eubatteri, che utilizzano formil-

metionina, la traduzione negli archeobatteri inizia con Metionina, come negli eucarioti.

5.Presenza di introni: Alcuni geni negli archeobatteri, in particolare quelli per tRNA e rRNA,

possono contenere introni.

.GENOMI EUCARIOTI

Il GENOMA EUCARIOTICO presenta una grande varietà nelle dimensioni e nelle strutture

genetiche, con un'importante frazione non codificante.

Nel 1948, Roger e Vendrely scoprirono che tutte le cellule di una stessa specie animale

possiedono una quantità costante di DNA (valore C), ma senza correlazione diretta tra il

valore C e la complessità dell'organismo.

Questo fenomeno, noto come paradosso del valore C, è stato risolto con la scoperta che una

grande parte del DNA non è codificante. Organismi apparentemente meno complessi, come le

alghe, possono avere un valore C molto più elevato rispetto a specie come l'uomo.

Le DIMENSIONI DEI GENOMI EUCARIOTICI variano notevolmente, ma questa diversità è

dovuta principalmente alla frazione non codificante.

Non vi è correlazione tra il numero di cromosomi e la complessità dell'organismo. Un

esempio significativo è il confronto tra il genoma umano e quello del lievito: sebbene il genoma

umano sia circa 250 volte più grande, il numero di geni codificanti proteine è simile (circa

20.000 nell'uomo e 6.000 nel lievito).

Nei VERTEBRATI OMEOTERMI (mammiferi e uccelli), il genoma è organizzato in ISOCORE

segmenti di DNA di oltre 300 kpb, che presentano una composizione omogenea di basi.

Le isocore pesanti sono associate a una bassa metilazione, una cromatina più aperta e la

presenza di geni housekeeping. Queste isocore sono classificate in base al contenuto di G+C:

• L1 e L2 (Light) povere di G+C, costituendo oltre il 60% del genoma.

• H1, H2, e H3 (Heavy) ricche di G+C, contengono la maggior parte dei geni e sono

caratterizzate da una densità genica elevata, soprattutto nelle classi H2 e H3.

I GENI EUCARIOTICI sono generalmente DISCONTINUI Vengono inizialmente trascritti come

lunghi RNA preocursori che subiscono un processo di maturazione nel nucleo: gli introni

vengono rimossi e gli esoni concatenati per formare il mRNA maturo.

Il mRNA viene poi traslocato nel citoplasma per la traduzione.

Nel genoma umano, si trovano circa 23.000 geni codificanti proteine e oltre 6.000 geni per

RNA non codificanti (ad esempio, rRNA, tRNA, miRNA).

La maggior parte dei GENI presenta in media 8-9 introni, con alcune eccezioni come il gene

della titina, che può contenere oltre 300 introni.

Esistono significative variazioni nella lunghezza e struttura degli esoni e introni:

.Gli esoni non terminali misurano solitamente tra 50 e 250 nt.

.Esistono anche microesoni (6 nt) e macroesoni (fino a 20.000 nt).

.Nel genoma umano, oltre il 90% della lunghezza dell'RNA precursore è costituita da introni.

Le proteine eucariotiche sono generalmente più grandi rispetto a quelle procariotiche, con

una lunghezza media di circa 375 amminoacidi nelle proteine umane rispetto ai 275

amminoacidi nelle proteine di Escherichia coli.

I geni altamente espressi sono più compatti, con introni assenti o di dimensioni ridotte, ma ci

sono eccezioni come nel caso del gene della titina, che è caratterizzato da una struttura

genica molto complessa e lunga.

RUOLO DEGLI INTRONI NELL’EVOLUZIONE DEI GENI EUCAIOTICI: è fondamentale, poiché

pur essendo comuni alla maggior parte dei geni eucariotici, vengono talvolta considerati inutili

e come una complicazione nel processo di espressione genica.

Tuttavia, gli introni sono in realtà una straordinaria fonte di VARIABILITA’ GENETICA, essi

permettono infatti di esplorare e acquisire un numero praticamente infinito di soluzioni

evolutive, aumentando la complessità dell'espressione genica.

Sebbene il numero di geni nei genomi procariotici ed eucariotici sia generalmente simile, il

potenziale di espressione dei geni eucariotici è notevolmente superiore, grazie alla presenza

di introni che permettono lo splicing alternativo.

Questo processo consente di generare una varietà molto maggiore di trascritti e proteine

rispetto ai geni procariotici, che non possiedono introni.

Il splicing alternativo è particolarmente evidente nell'uomo, dove oltre il 95% dei geni

discontinui subisce splicing alternativo, espandendo la complessità del trascrittoma e del

proteoma.

Dai circa 23.000 geni codificanti identificati, possono originarsi più di 200.000 trascritti

differenti, moltiplicando significativamente la diversità proteica.

I geni possono presentare differenze nelle regioni 5'- e 3'-UTR (non tradotte), che sono

fondamentali per la regolazione post-trascrizionale. Le diverse forme di mRNA espresse da uno

stesso gene possono dare origine a proteine con funzioni diverse, che potrebbero anche

essere antagoniste. Un esempio è la caspasi 9, un enzima che gioca un ruolo centrale nella

risposta alla morte cellulare. Il suo splicing alternativo produce due isoforme:

• CASP9 (isoforma costitutiva): 416 aminoacidi, induce apoptosi.

• CASP9S (isoforma più corta): 266 aminoacidi, agisce come inibitore dell'apoptosi.

Anche le differenze nelle regioni 5'- e 3'-UTR sono cruciali, poiché possono influenzare la

stabilità e l'efficienza di traduzione degli mRNA, con impatti significativi sul funzionamento

cellulare.

LO SPLICING ALTERNATIVO è un meccanismo estremamente importante per la

diversificazione delle proteine, che sono implicate in numerosi processi biologici, come lo

sviluppo e il funzionamento degli organismi.

Questo processo è ampiamente regolato e le sue disfunzioni sono associate a malattie

genetiche.

Un altro meccanismo evolutivo fondamentale è il riassortimento degli esoni (exon shuffling),

che ha contribuito all'emergere di nuove proteine nel corso dell'evoluzione.

Il riassortimento degli esoni può generare nuove combinazioni di esoni, facilitando la

creazione di proteine chimeriche o a mosaico, che contengono segmenti di geni diversi.

Questo processo è particolarmente rilevante quando un intero dominio proteico è codificato da

un singolo esone. Inoltre, l'exon shuffling può avvenire durante la ricombinazione meiotica

attraverso un crossing over diseguale, che consente lo scambio di esoni tra geni diversi.

Un esempio di exon shuffling si osserva nei fattori di coagulazione del sangue, che

presentano domini simili in diverse combinazioni, permettendo loro di svolgere funzioni

biologiche specifiche, come la coagulazione.

Oltre all'exon shuffling, un altro meccanismo di evoluzione dei geni è il processo di

esonizzazione, che può originare nuove varianti geniche. Questo può avvenire mediante

l'inserimento di elementi mobili all'interno degli introni, o attraverso la retrotrasposizione di

cDNA originato da mRNA. L'integrazione di siti di splicing funzionali all'interno di una regione

di DNA può anche generare nuovi esoni, contribuendo ulteriormente alla diversità genica.

Tuttavia, è importante notare che la maggior parte dei processi che generano variazioni

strutturali nel genoma sono potenzialmente deleteri. Infatti, molte di queste variazioni non

vengono fissate nella popolazione poiché sono sottoposte a un processo di selezione

negativa, che tende a eliminare le mutazioni dannose.

GLI PSEUDOGENI -> sono una classe di GENI INATTIVI presenti nei genomi eucariotici.

Sebbene siano privi di funzione, rappresentano una parte significativa del patrimonio genetico,

con una notevole similitudine di sequenza rispetto ai geni funzionali.

Gli pseudogeni non sono in grado di esprimere proteine e sono facilmente riconoscibili a

causa di questa somiglianza.

Nel genoma umano, sono stati identificati circa 19.000 pseudogeni, di cui circa il 40%

appartengono alla classe degli pseudogeni processati.

Un esempio interessante riguarda i geni olfattivi: molti di questi, che originariamente erano

attivi, sono diventati pseudogeni nell'uomo.

In particolare, si osserva una drastica riduzione nel numero di geni per i recettori dell'olfatto

(OR, Olfactory Receptors), che costituiscono una delle famiglie di geni più numerose nei

mammiferi. Negli uomini, circa la metà di questi geni sono diventati pseudogeni, mentre nei

mammiferi non primati ne esistono oltre un migliaio.

Origine degli pseudogeni; possono originare in due modi principali:

1. Pseudogeni duplicati: Si formano tramite la duplicazione genica, in cui una seconda

copia di un gene viene integrata in una nuova localizzazione del genoma.

2. Pseudogeni processati: Questi derivano da RNA messaggero (mRNA) trascritto dal

gene funzionale. Dopo la trascrizione, l'mRNA maturo, che contiene una coda di

poli(A), viene retrotrascritto in cDNA e successivamente integrato nel genoma.

Gli pseudogeni processati accumulano mutazioni casuali (ad esempio inserzioni, delezioni

o frameshift) che sfuggono al controllo della selezione negativa, rendendoli riconoscibili

come sequenze non funzionali. Inoltre, la mancanza del promotore rende l'espressione di

questi geni praticamente nulla.

Infine, è interessante notare che gli pseudogeni si trovano generalm