Biologia molecolare

Biologia molecolare

Introduzione

In questo corso si tratterà di ciò che sta alla base della vita, ovvero il flusso dell’informazione che passa a tutti i livelli:

• Cellula-cellula
• Organismo-organismo
• Generazione-generazione

Alla base di questo c’è il genoma che permette di mantenere l’informazione, di trasmetterla e di metterla in pratica.

Elementi base degli esseri viventi

Le forme di vita sono le più diverse, dalla singola cellula batterica all’organismo multicellulare eucariotico. Ma ci sono elementi comuni:

• Separazione ambiente esterno/interno
• Mantenimento dell’informazione biologica
• Trasmissione accurata dell’informazione biologica
• Utilizzo fonte di energia

Queste caratteristiche sono garantite dalle 4 macromolecole su cui si basa la vita cellulare, ognuna di queste ha una funzione e tutte sono formate da unità fondamentali:

• Acidi nucleici: mantenimento informazione genetica e regolazione (u.f. nucleotidi)
• Proteine: “macchinario” cellulare attività biochimica della cellula (u.f. aminoacidi)
• Lipidi: idrofobicità consente isolamento esterno/interno, compartimentazione (u.f. acidi grassi)
• Polisaccaridi: energia e solubilità proteine (u.f. monomeri di zuccheri)

Mantenimento informazione biologica

L’informazione è conservata e mantenuta grazie agli acidi nucleici. Il DNA è la principale molecola deputata a questo, ma in alcuni casi può essere l’RNA. Nella sua struttura è insita non solo la decodificazione dell’informazione, ma anche la possibilità di trasmettere in modo fedele tale informazione.

Trasmissione accurata dell’informazione biologica

Questa avviene tramite la copia dell’informazione genetica (replicazione) e la successiva segregazione, in modo tale da aver trasmesso alle cellule figlie l’informazione in modo fedele.

Dal codice alla vita: come il codice è decodificato

Le informazioni genetiche sono memorizzate nel genoma, ma devono essere “espresse” per essere utilizzate dall’organismo. L’espressione trasforma le informazioni sul genoma in prodotti, come l’RNA o le proteine, che svolgono funzioni cellulari. L’RNA è fatto copiando la sequenza di una regione del genoma in una molecola di RNA (trascrizione). L’RNA viene utilizzato direttamente dalla cellula (ncRNA) o utilizzato come informazione per la produzione diretta di una particolare proteina (traduzione).

Separazione e compartimentazione

Tutte le cellule hanno una separazione con l’ambiente esterno ad opera di una membrana cellulare (formata da lipidi) e talvolta anche una parete. Esiste però un ulteriore livello di organizzazione e compartimentazione che permette una separazione spaziale.

Procarioti: non hanno scomparti interni con membrana, ma comunque esistono regioni definite: il DNA cromosomico si trova in una regione chiamata nucleoide. Le regioni non specializzate di una cellula costituiscono il citoplasma.

Eucarioti: i cromosomi si trovano all’interno del nucleo. Diverse regioni aggiuntive legate alla membrana (organuli) hanno funzioni distinte. I mitocondri e i cloroplasti hanno i loro genomi. Il reticolo endoplasmatico e l’apparato di Golgi sono coinvolti nel processamento delle proteine. La separazione permette una regolazione molto fine: la trascrizione avviene nel nucleo, mentre la traduzione fuori. Inoltre, questa separazione permette anche di rendere più efficienti le reazioni enzimatiche, poiché se si riesce a concentrare in un determinato punto i reagenti questo facilita la reazione.

Concetti base di genetica

L’attività e l’interazione di tutti i geni di una cellula producono il fenotipo per quella cellula o quell’organismo. Il fenotipo è la caratteristica visiva di un organismo, mentre il genotipo è la sequenza collettiva del DNA. Ploidia è il numero di copie di un genoma. Il lievito può crescere sia come aploide (1 copia del suo genoma) sia come diploide (2 copie). Alcuni eucarioti più complessi sono poliploidi. Quando un organismo ha più di una copia del suo genoma, può esserci una mutazione solo in una copia di un gene. Le mutazioni sono generalmente recessive o dominanti. Quando il gene wild-type rimanente può mantenere la funzione nella cellula, la mutazione è recessiva. Per manifestare il fenotipo mutante sono necessarie due copie mutate. Quando il gene wild-type non può compensare il gene mutante, la mutazione è dominante. Una copia mutata produce un fenotipo mutante.

Atomi, molecole e legami chimici

• I protoni sono carichi positivamente, i neutroni sono neutri e gli elettroni sono carichi negativamente.
• Un atomo elettricamente neutro ha lo stesso numero di protoni ed elettroni.
• Gli atomi sono determinati dal numero atomico (numero di protoni).
• Il numero di massa è la somma di protoni e neutroni.
• La massa atomica è il numero di protoni più il numero di neutroni, si misura in Dalton (1/12 della massa del C-12).
• La disposizione degli elettroni in un atomo determina le sue interazioni con altri atomi.
• Gli elettroni si trovano in “gusci” separati che circondano il nucleo.
• Il guscio più interno contiene fino a 2 elettroni, il secondo e il terzo fino a 8 elettroni ciascuno. I gusci si riempiono dall’interno verso l’esterno.
• La disposizione più stabile e chimicamente non reattiva è quella che prevede il riempimento del guscio più esterno.

Legame covalente

Se il guscio esterno non è completo l’atomo è reattivo. Condividendo elettroni esterni, atomi diversi possono completare il guscio esterno e stabilizzarsi, si formano legami covalenti che sono alla base delle molecole. 1 elettrone condiviso: legame singolo. 2 elettroni condivisi: legame doppio. Ci sono anche doppi legami parziali (legame peptidico).

Forma e flessibilità del legame covalente

I legami covalenti formano rigide configurazioni geometriche caratteristiche degli atomi coinvolti. Quando il carbonio forma 4 singoli legami, sono equamente distanziati l’uno dall’altro in un tetraedro, come nel metano. Gli atomi possono ruotare liberamente su un singolo legame. In un doppio legame, la rotazione è limitata, quindi gli altri legami sono in un unico piano. Queste limitazioni influenzano la forma delle molecole biologiche.

Molecole polari

Gli elettroni sono talvolta condivisi in modo ineguale all’interno di un legame covalente. L’atomo con la quota maggiore dell’elettrone è parzialmente carico negativamente ed è quindi elettronegativo. Allo stesso modo, l’atomo con la quota minore è elettropositivo. Questa separazione della carica è un dipolo. I legami covalenti con un dipolo sono polari; i legami non polari non hanno alcuna separazione di carica. Le molecole polari interagiscono favorevolmente con l’acqua, ma le molecole non polari preferiscono associarsi tra loro (alla base della struttura delle membrane fosfolipidiche).

Interazioni non covalenti

I legami non covalenti sono più deboli, ma ciò li rende dinamici, si formano e si disfano velocemente. Sono presenti in:

• Legame proteine-DNA
• Doppia elica di DNA
• Componenti molecolari ribosoma

Le reazioni non covalenti sono fondamentalmente interazioni elettrostatiche:

• Ponti salini (interazioni ioniche tra atomi carichi).
• Legami idrogeno (interazioni tra atomi polari con cariche parziali).
• Interazioni di Van Der Waals (deboli attrazioni tra gli atomi a una certa distanza).

Ponti salini

Gli atomi a volte guadagnano o perdono completamente gli elettroni, diventando ioni: anioni (negativi) o cationi (positivi). Gli ioni caricati interagiscono molto fortemente tra loro in interazione ionica o ponte salino. Nei ponti salini l’attrazione tra gli atomi carichi non dipende dall’orientamento, si estende in tutte le direzioni, cambia solo in funzione della distanza (l’energia attrattiva diminuisce al crescere della distanza).

Legame ponte idrogeno

È un particolare tipo di legame non covalente in cui l’interazione è data dalla carica parziale risultante da un legame covalente polare. Tipico quello tra molecole d’acqua. È influenzato dall’angolo dei 2 dipoli, è direzionale.

Interazioni di Van der Waals

Le interazioni di Van der Waals si verificano tra tutti gli atomi, siano essi carichi o meno. Esse avvengono a distanza specifica tra gli atomi. I movimenti degli elettroni intorno agli atomi creano costantemente dipoli transitori. Se un atomo con un dipolo è vicino ad un altro atomo, induce un dipolo nel secondo atomo. Le cariche deboli si attraggono e stabilizzano i dipoli.

Influenza dell’ambiente acquoso

La vita si svolge in ambiente acquoso in quanto la cellula è un ambiente acquoso, e quindi le interazioni delle molecole biologiche con l’acqua sono significative. Le molecole non polari non interagiscono favorevolmente con l’acqua: molecole idrofobiche. Le molecole polari, che interagiscono con l’acqua, sono idrofile. Le interazioni idrofobiche guidano il ripiegamento molecolare. Le regioni idrofobiche si associano tra loro ed escludono l’acqua. Le regioni idrofile si trovano quindi sulla superficie esterna della molecola dove possono interagire con l’acqua.

Acidi nucleici

Le macromolecole biologiche sono formate dalla ripetizione di unità fondamentali, nel caso degli acidi nucleici queste sono i nucleotidi. Le leggi della fisica e della chimica controllano come si formano le molecole e come interagiscono tra loro e svolgono le loro funzioni. Gli acidi nucleici (DNA e RNA) sono le molecole deputate, come prima funzione, all’immagazzinamento e alla trasmissione delle informazioni genetiche.

Nucleotidi

Comprendono una base, uno zucchero e un fosfato. I nucleotidi hanno funzioni biologiche aggiuntive, come l’immagazzinamento dell’energia (ATP) e il trasporto molecolare. Nei nucleotidi si trovano due tipi di molecole di zucchero:

• Il DNA contiene 2’-deossiribosio
• L'RNA contiene ribosio, che ha un atomo di ossigeno aggiuntivo

In questi zuccheri, i carboni sono numerati da 1’ a 5’. Delle 3 componenti dei nucleotidi quella che può variare è la base: le basi sono anelli planari che sono tipicamente non carichi in condizioni fisiologiche, questo fa sì che siano idrofobiche e va a impattare quella che è la struttura degli acidi nucleici, soprattutto del DNA. DNA e RNA sono caratterizzati da due tipi di basi: purine (adenina e guanina) e pirimidine (citosina, timina e uracile).

• Il DNA contiene le basi adenina, guanina, citosina e timina
• L'RNA non ha timina, ma si usa invece l’uracile

Composizione dei nucleotidi

Ogni base azotata è unita ad uno zucchero da un legame glicosidico tra il C1’ dello zucchero e l’N1 di una pirimidina o N9 di una purina. Base + zucchero = nucleoside. I nucleosidi prendono il nome dalle basi: adenosina, guanosina, citidina, timidina e uridina. Nucleoside + fosfato = nucleotide. I gruppi fosfato sono legati al C5’ dello zucchero tramite un legame fosfoesterico. Nel polimero i nucleotidi sono uniti da un legame fosfodiesterico tra il 3’ idrossile di uno zucchero e il fosfato attaccato al 5’ idrossile dello zucchero successivo. I filamenti sono quindi direzionali – un’estremità ha 3’-OH esposto, l’altra estremità ha un 5’-P esposto. Per convenzione, le sequenze di acidi nucleici sono scritte nella direzione da 5’ a 3’. Gli zuccheri e i fosfati formano un’unità che si ripete: lo scheletro zucchero-fosfato; la spina dorsale è sempre la stessa, ma le basi annesse variano.

Basi azotate

Le basi azotate possono anche esistere come tautomeri (o isomeri tautomerici), una molecola in cui un protone è migrato in un luogo diverso, ma i tautomeri sono meno dello 0,01%. I tautomeri hanno implicazioni sull’accuratezza della replicazione del DNA e possono fornire variabilità genetica.

• Adenina e citosina nella forma classica sono ammine, ma possono esistere come tautomeri in forma imminica.
• Guanina e timina nella forma classica sono chetoni, ma possono esistere come tautomeri in forma enolica.

In entrambi i casi, la forma amminica e la forma chetonica sono estremamente favorite e presenti. La funzione dei nucleotidi non è vincolata solo alla molecola dell’informazione genetica, ma è anche alla base di molecole importanti per altre funzioni: conservazione dell’energia (es. ATP), possibilità di trasferire gruppi chimici ad altre molecole (es. CoA).

DNA

Come si è arrivati a conoscere che il DNA è la molecola dell’informazione genetica? Il DNA viene scoperto nel 1868 da Friedrich Miescher presso l’Università di Tubinga in Germania. Viene isolata da globuli bianchi del sangue, una sostanza ricca di fosforo, che viene chiamata nucleina. Subito il DNA viene identificato come polimero di nucleotidi, ma la grandezza media stimata era 1000 Da (estremamente piccola) equivalente a 4 nucleotidi; da qui il modello tetranucleotide, troppo semplice per essere la sede dell’informazione genetica. Quello che fa cambiare la prospettiva è, all’inizio degli anni ’30, quando vengono migliorate le tecniche di estrazione del DNA e ci si accorge che non è così piccolo il DNA acquista dignità come molecola complessa.

Esperimenti cruciali

Gli esperimenti che sanciscono che il DNA è la molecola responsabile di trasmettere informazione genetica sono 3 esperimenti cruciali:

1. 1928 esperimento di Griffith: scoperta del principio trasformante c’è una molecola in grado di trasmettere informazioni da una cellula a un’altra.
2. 1944 esperimento di Avery: il DNA è il principio trasformante (esperimento della bomba di Avery).
3. 1952 esperimento di Chase e Hershey: conferma definitivamente la teoria di Avery.

1928 esperimento di Griffith: il principio trasformante

Griffith identifica 2 tipi di ceppi di Streptococco, in cui uno di questi fa nascere su piastra delle colonie rugose; questo ceppo è definito ceppo R ed è benigno, quindi se viene inoculato in un topo, il topo sta bene. Invece, il ceppo S, che dà origine a delle colonie lisce, se viene inoculato in un topo ne provoca la morte, quindi questo ceppo è virulento. La differenza tra i due ceppi sta nel capside (all’epoca non si sapeva): il ceppo R non è in grado di fare un capside polisaccaride e quindi viene riconosciuto dal sistema immunitario e debellato, mentre il ceppo S è in grado di fare un capside polisaccaride che lo protegge e lo rende infettivo portando alla morte del topo. Griffith prende il ceppo S virulento e lo tratta al calore uccidendolo, lo inietta nel topo e vede che non ha nessun effetto, infatti il topo sopravvive. La cosa che sorprende Griffith è che se lui prende il ceppo S inattivato al calore e lo unisce al ceppo R, l’unione dei due ceppi causa la morte del topo. Griffith conclude che ci deve essere qualche informazione del ceppo S inattivato che viene trasferita al ceppo R e lo rende virulento. Se isola i batteri che inizialmente erano rugosi, nota che sono diventati lisci e quindi virulenti.

1944 esperimento di Avery: il DNA è il principio trasformante

È un esperimento più a base molecolare, Avery si basa solo sulla forma degli Pneumococchi: ceppo liscio è quello virulento, mentre quello rugoso è benigno. Avery prende le cellule isolate da un ceppo liscio virulento e separa, attraverso un frazionamento, le diverse componenti cellulari isolandole: da un lato arricchisce di proteine, da un lato di RNA, di DNA, di lipidi e di polisaccaridi. A questo punto non ha più un miscuglio che aveva Griffith ma vuole capire quale di queste 5 macromolecole è il principio trasformante. Separate queste 5 macromolecole ripete l’esperimento di Griffith: prende delle cellule che derivano da una colonia rugosa quindi benigna e le mischia con niente e con le 5 macromolecole isolate e va a vedere la forma.

• Ceppo rugoso + niente = ceppo rugoso
• Ceppo rugoso + proteine = ceppo rugoso
• Ceppo rugoso + RNA = ceppo rugoso
• Ceppo rugoso + lipidi = ceppo rugoso
• Ceppo rugoso + polisaccaridi = ceppo rugoso
• Ceppo rugoso + DNA = ceppo liscio quindi il principio trasformante è il DNA: nel DNA c’è l’informazione che consente allo Pneumococco liscio di fare il suo capside che lo protegge dal sistema immunitario del topo.

1952 esperimento di Chase e Hershey: conferma della teoria di Avery

Prendono due categorie di fagi:

1. In un caso un fago viene cresciuto con zolfo radioattivo e lo zolfo diventa parte della componente proteica del fago, ma non del DNA poiché nel DNA non è presente zolfo;
2. In una seconda popolazione di fagi il DNA viene marcato con fosforo radioattivo, infatti nel DNA è presente una grande quantità di fosforo.

Quindi da una parte si hanno fagi con proteine marcate e dall’altra parte fagi con DNA marcato. Dopodiché fanno infettare i batteri; i fagi devono immettere il loro principio trasformante nei batteri per poi essere replicati e dare origine a nuove particelle fagiche. Chase e Hershey vogliono vedere se trasmettono le proteine o il DNA: dopo che avviene l’infezione in un frullatore i virus vengono staccati dalle cellule e:

1. Dove avevano marcato le proteine, la parte radioattiva resta tutta nel supernatante quindi con il capside e nulla è stato trasferito alla cellula;
2. Mentre nella frazione in cui era stato marcato il DNA, si vede che i batteri presentano al loro interno il DNA marcato radioattivamente.