Biologia molecolare

La ricombinazione non omologa (NHEJ)

La ricombinazione non omologa (NHEJ) è un tipo di riparazione della doppia elica molto veloce, usata in casi di emergenza principalmente nelle cellule eucariotiche. Tuttavia, è una replicazione non accurata, ma è sempre meglio che bloccare completamente la replicazione e perdere tutta l'informazione genetica. Si verifica nella fase G1 e quindi prima della replicazione del DNA sia in cellule aploidi che diploidi. Il riconoscimento della rottura della doppia elica avviene da parte di proteine specifiche chiamate Ku70, Ku80 e DNA-PK che legano le estremità rotte e come un ponte le rimettono vicine. Queste proteine vengono a loro volta riconosciute da un complesso chiamato MRN (una esonucleasi composta da MRE11, RAD50 e NBS1) che rimuove parzialmente le estremità. Poi interviene una Ligasi 4 associata a XRCC4 che ricuce i due filamenti. Agendo così però vengono rimossi alcuni nucleotidi che vengono persi (per questo è una

riparazioneinaccurata ma veloce).

6.3.2. La Ricombinazione Omologa (HR)

La Ricombinazione Omologa è un processo riparativo molto accurato e abbastanza veloce usato sia da procarioti che da eucarioti. Questo processo però funziona solo in fase S e G2 perché prevede l'utilizzo di un cromosoma omologo o di un cromatidio fratello da usare come stampo intatto. Quando avviene una rottura, viene riconosciuta dal complesso MRN (lo stesso della ricombinazione non omologa) che degrada i nucleotidi sui due filamenti ma in direzione opposta, producendo delle estremità coesive a singolo filamento. A questo punto intervengono le SSB (RPA in eucarioti) per proteggere le estremità coesive. Successivamente le proteine Rad51 scalzano le RPA e si mettono al loro posto insieme ad altre proteine ricombinative. Ora i filamenti singoli sono pronti per invadere il cromosoma fratello o omologo andando a ricercare la sequenza corrispondente. Una volta trovata si legano con i legami

canonici della doppia elica (scalzando le Rad51) formando la Giunzione di Holliday. Poi vengono quindi esposte delle estremità 3'-OH che permettono alla Polimerasi di risintetizzare i nucleotidi che erano stati tolti dal complesso MRN (insieme a quelli eventualmente danneggiati). Infine, intervengono una DNA Ligasi e una Risolvasi che riportano il filamento sintetizzato e riparato sul cromosoma di partenza. Il chiasma o giunzione di Holliday quindi non è fissa ma si sposta man mano che il DNA viene sintetizzato.

Nei procarioti il meccanismo è lo stesso con alcune differenze: il danno viene riconosciuto da RecBCD che denatura il DNA e fa una attività esonucleasica fino alla sequenza X che gli fa cambiare il filamento da degradare, invertendo la sua direzione, generando anche qui estremità coesive.

6.3.3. I Checkpoint

Quando avvengono i danni al DNA, si attivano i checkpoint ovvero dei sensori che regolano la risposta cellulare, attivando la riparazione

La combinazione del DNA avviene attraverso la replicazione e la divisione cellulare. Durante questo processo, esistono dei checkpoint che controllano l'integrità del DNA e possono arrestare la divisione cellulare se vengono rilevati danni al DNA. Questi checkpoint sono in grado di riconoscere quando un danno è irreparabile e possono avviare l'apoptosi cellulare.

I sistemi di checkpoint dipendono da sensori proteici come ATR e ATM, che sono proteine chinasi. ATR e ATM si legano a proteine e strutture di riparazione del DNA, come ad esempio il DNA a singolo filamento, e generano una serie di fosforilazioni che attivano una cascata di segnalazione e una risposta cellulare.

Se il danno al DNA è lieve, si attiva solo ATM, che attiva una risposta non accurata chiamata NHEJ. Se il danno al DNA è più esteso, si attivano sia ATR che ATM, che attivano una risposta più accurata chiamata HR.

ATR e ATM regolano quindi la risposta della cellula al danno al DNA attraverso l'interazione con proteine come p53 e cdc25. Queste proteine sono molto importanti perché agendo su di esse impediscono alla cellula di entrare in mitosi. Questo blocco della mitosi avviene attraverso l'inattivazione/fosforilazione della CDK-ciclina.

cdc25 che la fosforilano o la p53 che attiva CKI/p21 che stabilizza la fosforilazione) non avvia la mitosi.

6.4. Ricombinazione omologa in meiosi

La Ricombinazione omologa non avviene solo per riparare le rotture del doppio filamento, ma anche per fare il Crossing-Over meiotico, ovvero quello scambio di informazioni genetiche dei cromosomi omologhi. Il crossing-over si basa sul concetto che in anafase I del processo meiotico, si taglino i cromosomi omologhi e si formi una giunzione di Holliday che migra e sposta un pezzo a singolo filamento sull'altro cromosoma omologo, facendo agire poi una Polimerasi che sintetizza le nuove basi introdotte dal cromosoma omologo. Poi però si genera una seconda giunzione di Holliday che deve essere risolta tramite un taglio. In base al tipo di taglio che avviene si possono avere 2 risultati differenti: una vera e propria ricombinazione se i tagli sono asimmetrici sulle due giunzioni e una situazione uguale a quella di partenza se i tagli alle giunzioni sono identici.

La risoluzione della giunzione di Holliday avviene da parte delle RisolvasiRuvAB e RuvC che grazie a RuvA riconosce tutti e 4 i filamenti dellagiunzione mentre RuvB srotola il DNA e fa muovere la giunzione. RuvC invecetaglia i filamenti.

6.5. La Ricombinazione per trasposizione

Nella cellula ci sono altri metodi per spostare le informazioni da un puntoall'altro dei vari o dello stesso cromosoma. Uno di questi è laRicombinazione per trasposizione. Questo metodo utilizza i Trasposoni,cioè dei pezzi di DNA mobili che vengono spostati da un punto all'altrodel cromosoma con 2 metodi: con replicazione (lasciando una copia nellavecchia posizione) o senza replicazione (non lasciando nessun suo residuonella vecchia posizione). I trasposoni in linea generale si spostano inmodo casuale senza riconoscere una sequenza specifica e sono presenti confrequenze differenti nei vari organismi. Esistono due tipi di trasposoni:i trasposoni a DNA e i retrotrasposoni (che si

Questo complessosinaptico taglia tra il punto della sequenza ripetuta e invertita e il resto del DNA, generando estremità 3’-OH sulle estremità 3’ (il taglio sul DNA donatore viene riparato con HR o NHEJ). Successivamente il frammento tagliato (il trasposone) si sposta e si integra sul DNA bersaglio grazie alle estremità 3’-OH che in modo casuale si attaccano ad un fosfato della catena nucleotidica. Ma questa integrazione avviene in modo leggermente sfalsato (2-9 nucleotidi) e quindi si formano due GAP sui due lati che vengono colmati dalla DNA Polimerasi. Ma questo porta ad una duplicazione di nucleotidi che erano già presenti prima e per questo nascono siti di bersaglio duplicati (questa duplicazione è caratteristica di tutti i trasposoni). Oltre al metodo del “taglia e cuci” però è anche possibile un altro metodo: la Trasposizione Replicativa. In questo metodo le Trasposasi tagliano il trasposone sempre a livello

delle sequenze ripetute e invertite, ma questa volta solo su un filamento, a destra e a sinistra, ma creando sempre le estremità 3'-OH. In questo modo però sul DNA bersaglio va ad attaccarsi anche tutto il DNA donatore, creando delle interruzioni e quindi forcelle replicative, che portano ad una replicazione del trasposone. Alla fine, il risultato è che il filamento donatore e il filamento bersaglio sono uniti da due copie dello stesso trasposone per formare un'unica grande molecola che prende il nome di cointegrato.

6.5.2. I Retrotrasposoni simil retrovirali o LTR

I retrotrasposoni LTR presentano delle lunghe sequenze ripetute ai lati: le Long Terminal Repeat (da cui viene il nome LTR). Inoltre, all'interno del trasposone si trovano i geni che codificano sia per i loro enzimi dedicati a muovere il trasposone stesso (le Integrasi) e per codificare il DNA a partire dell'RNA (Trascrittasi inversa). Questi due geni sono comunque trascritti grazie alla presenza di

Un promotore posto sulle sequenze LTR. I retrotrasposoni lavorano utilizzando un intermedio a RNA, ovvero una RNAPolimerasi cellulare riconosce il promotore sull'LTR e inizia a creare un mRNA. Poi l'mRNA viene prima tradotto per produrre gli enzimi necessari e poi retrotrascritto in cDNA grazie alla Trascrittasi Inversa. Infine, interviene l'Integrasi che taglia le estremità 5' per ottenere estremità 61 sporgenti e integra il trasposone grazie alle estremità 3'-OH sempre in modo sfalsato.

6.5.3. I Retrotrasposoni non retrovirali o Non-LTR o poli-A

I retrotrasposoni non retrovirali sono trasposoni che utilizzano un intermedio a RNA ma non presentano le sequenze ripetute alle estremità (le LTR) presentano invece, sempre alle estremità, delle sequenze 5'->3' UTR. Inoltre, sono presenti due geni all'interno: ORF1 (che codifica una proteina che lega l'RNA) e ORF2 (che codifica una proteina con attività sia

di trascrittasi inversa che endonucleasica). Su una estremità del trasposone sono anche presenti delle brevi sequenze ripetute di A-T (le poli-A).

Il retrotrasposone viene trascritto da una RNA Polimerasi e poi tradotto per produrre le proteine ORF1 e ORF2 che rimangono associate allo stampo mRNA creando un complesso ribonucleoproteico. Poi ritorna nel nucleo alla ricerca del DNA bersaglio che deve avere delle sequenze ricche in T (che vengono riconosciute dal tratto poli-A).

Successivamente, ORF2 ha il compito di tagliare le sequenze ricche in T del DNA in modo tale che la coda poli-A si leghi al DNA andando a creare un ibrido DNA-RNA. Si genera così un complesso innesco stampo col 3’-OH che permette a ORF2 di sintetizzare il cDNA. Poi l’RNA retrotrascritto viene degradato e viene sintetizzato il secondo filamento di cDNA.