Biologia molecolare

Biologia molecolare: avviso di utilizzo

Nei vari capitoli si trovano delle parole in grassetto, colorate o evidenziate per indicarne l’importanza e la necessaria memorizzazione. In particolare, alcune parole possiedono vari colori per facilitarne la memorizzazione da parte del lettore. Tutte le immagini e le tabelle (compresi i testi all’interno) inserite nei vari capitoli contengono informazioni importanti e devono essere studiate per poter superare l'esame.

Come è organizzata questa dispensa

Questa dispensa può essere studiata in soli 13 giorni! La dispensa è già suddivisa in 13 parti, in cui alla fine di ogni parte è presente una pagina che ti indica la fine della giornata di studio. In questo modo, non devi preoccuparti di organizzare il lavoro! Dopo lo studio di questa dispensa, ti consigliamo di prenderti qualche giorno per ripassare gli argomenti, in modo da arrivare preparato al giorno dell'esame. Buono studio!

Sommario

• Introduzione ............................................................. 5
• La struttura degli acidi nucleici ....................................... 6
• Struttura chimica degli acidi nucleici ................................. 6
• Struttura fisica del DNA: la doppia elica e i suoi parametri strutturali ........... 12
• Topologia del DNA e DNA topoisomerasi ................................. 13
• Le Topoisomerasi .................................................... 15
• Il funzionamento delle DNA Topoisomerasi ............................ 16
• Struttura dell’RNA .................................................... 17
• Tipi e funzioni dell’RNA ............................................ 17
• Gli acidi Nucleici: Tecniche di base .................................. 20
• Estrazione degli acidi nucleici ....................................... 20
• Lisi delle cellule .................................................. 20
• Purificazione del DNA ............................................... 21
• Concentrazione del DNA e RNA ........................................ 22
• Separazione degli acidi nucleici mediante elettroforesi su gel ........ 23
• Enzimi di restrizione ................................................. 24
• Clonaggio del DNA ..................................................... 25
• Vettore di clonaggio ................................................ 25
• Vettore di espressione .............................................. 26
• Il legame tra frammento e vettore ................................... 26
• Clonaggio di prodotti di PCR ........................................ 27
• Selezione di batteri ................................................ 28
• Tecnica di ibridazione su colonia ..................................... 28
• Struttura della Cromatina e del Nucleosoma ............................ 30
• Impacchettamento del Genoma batterico ed Eucariotico .................. 30
• Struttura del Cromosoma ............................................. 30
• Nucleosomi e proprietà della Cromatina ................................ 31
• Struttura del Nucleosoma ............................................ 31
• Strutture di ordine superiore della cromatina ....................... 32
• Regolazione della cromatina ........................................... 33
• Modifiche delle code istoniche ...................................... 34
• Genomi Procariotici ed Eucariotici .................................... 35
• Pseudogene .......................................................... 35
• La replicazione del DNA ............................................... 37
• Replicazione semiconservativa ......................................... 37
• Origine di replicazione ............................................... 37
• La sintesi del DNA .................................................... 37
• La DNA Polimerasi e il suo funzionamento ............................ 38
• Gli ioni metallici ................................................ 39
• Le Sliding Clamp .................................................... 41
• La forca replicativa ................................................ 41
• La RNA Primasi ...................................................... 43
• Le Topoisomerasi nel processo replicativo ........................... 44
• Meccanismo di replicazione nei Procarioti (E. Coli in particolare) .... 44
• Meccanismo di replicazione negli Eucarioti ............................ 48
• Meccanismo di replicazione dei Telomeri Eucariotici ................... 49
• Le Telomerasi ....................................................... 50
• Assemblaggio dei Nucleosomi ........................................... 51
• Replicazione in vitro: PCR e sequenziamento del DNA ................... 53
• PCR (Reazione a catena della Polimerasi) .............................. 53
• Sequenziamento del DNA con il metodo della terminazione della catena .. 54
• Danno al DNA, riparazione e ricombinazione ............................ 54
• Riparazione dei MissMatch della Replicazione .......................... 55
• Riparazione delle basi danneggiate .................................... 56
• Riparazione dei danni alla doppia elica ............................... 57
• La Ricombinazione non omologa (NHEJ) ................................ 58
• La Ricombinazione Omologa (HR) ...................................... 58
• I Checkpoint ........................................................ 59
• Ricombinazione omologa in meiosi ...................................... 59
• La Ricombinazione per trasposizione ................................... 60
• I trasposoni a DNA .................................................. 60
• I Retrotrasposoni simil retrovirali o LTR ........................... 61
• I Retrotrasposoni non retrovirali o Non-LTR o poli-A ................ 62
• La Ricombinazione Conservativa Sito-Specifica (CSSR) .................. 63
• La Trascrizione ....................................................... 66
• L’inizio, l’allungamento e la fine .................................... 67
• La RNA Polimerasi ..................................................... 67
• La Trascrizione nei Procarioti e la sua regolazione ................... 68
• La Regolazione della Trascrizione nei Procarioti .................... 74
• Regolazione dell’Operone Lac inducibile (Metabolismo del Lattosio) in E.Coli ..................................................................... 74
• Regolazione dell’Operone Trp reprimibile (Sintesi del Triptofano) in E.Coli ..................................................................... 77
• La Trascrizione negli eucarioti e la sua regolazione .................. 78
• Lo Splicing ........................................................... 84
• Ulteriori maturazioni dell’RNA: Editing ............................... 91
• Ulteriori maturazioni dell’RNA: Traslocazione nucleo-citoplasmatica ... 92
• La Traduzione ......................................................... 95
• Gli attori della traduzione: mRNA, tRNA e Ribosomi .................... 95
• Inizio della traduzione in Procarioti e Eucarioti .................... 103
• La fase di allungamento .............................................. 105
• La fase di terminazione .............................................. 107
• La regolazione della traduzione in Procarioti ed Eucarioti ........... 109
• Meccanismi di controllo della qualità degli mRNA ..................... 110
• Il codice genetico ................................................... 112
• Gli RNA Regolatori ................................................... 112
• Esercizi d’esame ...................................................... 113

Introduzione

Il dogma centrale della biologia molecolare è il flusso dell’informazione genetica, ovvero come viene trasferita l’informazione codificata nel DNA alle proteine. Francis Crick nel 1956 scrisse questo dogma proponendo come tesi la “Dottrina della Triade”. Egli ipotizzava che l’informazione contenuta nel DNA venisse prima trascritta nell'RNA e poi tradotta nella sequenza amminoacidica delle proteine. Inoltre, affermava che dalle proteine non si potesse mai tornare al DNA.

Le seguenti ricerche e scoperte scientifiche portarono a confermare la tesi di Francis Crick, tanto che oggi è ormai avvalorato che il DNA è la molecola che contiene, trasporta ed eredita le informazioni, e l'RNA è la molecola che può trasmettere le informazioni necessarie alla sintesi delle proteine. In realtà l'RNA possiede anche altri compiti e non serve solo alla sintesi delle proteine. I diversi tipi di RNA saranno descritti nei vari capitoli.

La struttura degli acidi nucleici

Struttura chimica degli acidi nucleici

DNA e RNA sono catene polinucleotidiche, ovvero sono polimeri lineari di Nucleotidi. I nucleotidi sono delle molecole organiche formate da tre componenti: Uno zucchero pentoso (formato da 5 atomi di carbonio e un ossigeno disposti ad anello), una base azotata (contiene diversi atomi di azoto) e uno o più gruppi fosfato (formati da fosforo e ossigeno).

Lo zucchero pentoso può essere Ribosio (nel caso del RNA) o Deossiribosio (nel caso del DNA), cioè può contenere o meno un atomo di ossigeno legato al carbonio 2 dell’anello carbonioso. La mancanza dell’atomo di ossigeno nello zucchero del DNA rende la molecola più stabile. Lo zucchero e la base azotata si uniscono mediante un legame N-β-glicosidico per dare origine al Nucleoside. Questo legame si instaura tra il carbonio 1 dello zucchero e l’Azoto 9 nelle Purine o l’Azoto 1 nelle Pimiridine.

Le basi azotate si dividono in queste due categorie: Le Purine hanno un doppio anello e comprendono l’Adenina (A) e la Guanina (G). Le Pimiridine hanno un singolo anello e comprendono la Citosina (C), la Timina (T) e l’Uracile (U). La Timina è presente solo nel DNA e viene sostituita dall’Uracile nell’RNA.

Il gruppo fosfato si lega al carbonio 5 o 3 dello zucchero per generare il Nucleotide che è il “mattoncino" con cui viene costruita tutta la catena polinucleotidica dell’acido nucleico. Quando i nucleotidi sono uniti per formare la lunga catena di DNA o RNA, il gruppo fosfato unisce i due zuccheri: una volta in posizione 5 e nell’altra in posizione 3. In questo modo si genera anche una sorta di “direzione di lettura” del DNA/RNA (5’→3’o 3’→5’: si legge: dal cinque primo al tre primo o dal tre primo al cinque primo).

Nel DNA questi mattoncini si chiamano Deossiribonucleotidi (o anche deossiribonucleosidi 5’ monofosfato) e nel RNA si chiamano Ribonucleotidi (o anche ribonucleoside 5’ monofosfato). Il gruppo fosfato è in grado di dare una caratteristica acida alle molecole per cui nella nomenclatura dei Nucleotidi si antepone la parola “Acido”. Nelle cellule sono presenti delle eccezioni dove uno o più gruppi fosfato sono legati in posizioni diverse (es. 3’; 2’; 2’ e 3’; 3’ e 5’).

Possono essere presenti nella cellula anche dei Nucleosidi che contengono fino a 3 gruppi fosfato (es. ATP). Come abbiamo già visto, nelle catene polinucleotidiche il gruppo fosfato è in grado di legarsi con due zuccheri contemporaneamente mediante un legame fosfodiesterico e formare lunghe catene di Nucleotidi. Questo legame avviene tra i carboni 5’ e 3’ dello zucchero ed è instaurato nella cellula dalla DNA (o RNA) Polimerasi. È possibile dare un ordine di lettura alla catena polinucleotidica proprio grazie alla direzione in cui lavora la Polimerasi. Essa, infatti, lavora solo in direzione 5’→3’.

Nel DNA, essendoci 4 tipi diversi di basi azotate, esistono 4 tipi diversi di Nucleotidi che legati insieme uno dopo l’altro nel giusto ordine, danno origine alla vera e propria informazione genetica. Le catene con meno di 50 Nucleotidi sono dette Oligonucleotidi, mentre quelle da più di 50 sono dette Polinucleotidi. Riassumendo, lo zucchero (Ribosio o Deossiribosio) si lega in lunghe catene con il gruppo fosfato per formare l’impalcatura del DNA o RNA su cui potranno attaccarsi le basi azotate che una dopo l’altra formano un codice che porta l’informazione genetica.

Struttura fisica del DNA: la doppia elica e i suoi parametri strutturali

Nel 1953 J.D. Watson e F.H.C. Crick pubblicarono le loro scoperte riguardo la forma della molecola di DNA. In base ai dati ottenuti dai loro esperimenti, Watson e Crick affermarono che la struttura del DNA è una doppia elica destrorsa antiparallela. Il DNA è quindi doppio, formato cioè da due filamenti, ognuno con la propria struttura nucleotidica.

La doppia elica rivolge verso l’esterno l’impalcatura carbonio-fosfato e verso l’interno le basi azotate che si legano tra loro mediante legami idrogeno, i quali contribuiscono a mantenere uniti i due filamenti. I legami idrogeno (detti in questo caso anche legami di Watson e Crick) che si formano, sono specifici per precise basi azotate, ovvero le Citosine si legano solo con le Guaninee le Timine solo con le Adenosine e viceversa. I due filamenti sono quindi complementari e antiparalleli (cioè se un filamento va in direzione 5’→3’, l’altro gli prosegue sopra in direzione 3’→5’, assumendo di leggere la sequenza da sinistra verso destra).

La complementarità tra le basi consente ad ogni filamento di essere l’opposto dell’altro e quindi da ogni filamento è possibile ottenere il suo opposto secondo le regole di Watson e Crick (G con C e A con T). A causa dell’angolo di legame che si forma tra lo zucchero e la base azotata (l’angolo non è esattamente 180°), quando i due filamenti vengono accoppiati in modo antiparallelo, la doppia elica presenta una certa asimmetria dove si forma un solco maggiore (largo 22 Å) e un solco minore (largo 12 Å). Questa differenza genera delle “aperture” nella doppia elica che consentono a delle α-eliche proteiche di formare legami con le basi azotate rivolte all’interno.

Questo modello di DNA (detto modello B) non è l’unico possibile ma è il più favorito in vivo o in soluzione acquosa in vitro. Infatti, la stabilità della doppia elica non è data solo dai legami idrogeno ma anche dal loro impilamento (che risulta leggermente sfalsato se visto dall’alto). Infatti, le basi azotate sono idrofobiche e l’ambiente cellulare è fortemente acquoso (questo permette il collasso idrofobico della molecola che tende a far rimanere le basi azotate verso l'interno).

Nel modello B si trovano 10,5 basi per ogni giro d’elica. Le altre forme più comuni di DNA sono il modello A e il modello Z. Il modello A è presente solo in vitro in condizione di bassa umidità. Tale conformazione presenta una doppia elica che si mantiene destrorsa ma è più schiacciata. Il modello Z invece è presente anche in vivo perché viene generato da specifiche sequenze di Nucleotidi. Queste sequenze sono un’alternanza di Citosine in conformazione Anti (che è la norma per il DNA in forma A e B sia per le guanine che per le citosine) e Guanine in conformazione Syn. Tale conformazione sposta la base azotata sopra l’anello carbonioso, facendola ruotare, e genera una forma a zig-zag. La doppia elica risulta più allargata e inverte il senso diventando sinistrorsa.

Il DNA in forma Z è possibile trovarlo nei Telomeri o comunque in tutto il DNA dato che in alcuni punti avviene uno cambio di forma da B a Z per poi riprendere la forma B. Il DNA può formare alcune strutture particolari, diventando a tripla elica. La tripla elica si crea tra un DNA Duplex (sinonimo di doppio filamento) lungo circa 20-30 coppie di basi avente un filamento di sole pirimidine e l’altro filamento di sole purine e una terza catena polinucleotidica composta di sole pirimidine, complementare alla sequenza purinica con cui interagisce (Quindi si genera un collegamento PIRIMIDINE—PURINE—PIRIMIDINE). Questa particolare interazione che si forma tra le basi vengono chiamate “interazioni di Hoogsteen”.

Un’altra particolare struttura sono i Quartetti di G (detti anche Tetraplex di guanosine). Questi quartetti comprendono un singolo filamento (sia di DNA che di RNA) ricco di Guanosine che instaurano fra loro legami idrogeno e portano il filamento a ripiegarsi per formare delle anse. Questa particolare struttura è stata rintracciata maggiormente nei Telomeri e non è ancora chiara la loro funzione.

Nel caso in cui il DNA presenti delle zone palindrome (dove la sequenza nucleotidica è la stessa se letta da destra o da sinistra rispetto a un punto centrale, il quale può contenere un certo numero di basi non accoppiate o può anche essere assente se non c'è nessuna base che lo compone), le basi complementari rispetto allo stesso filamento formano delle strutture cruciformi dove le anse terminali rappresentano il “centro” della palindromia.