Biochimica delle trasformazioni alimentari

DOT BLOTTING

1)Sulla membrana viene depositato il campione

La membrana viene saturata con composto inerte

Aggiunta anticorpo (presente in PBS) che ricerca uno specifico antigene

Attacco dell’antigene e lavaggi successivi

2) anticorpo secondario che riconosce il primario, è coniugato con un enzima

(riconosce le specie es. l’anticorpo in coniglio, poi in un altro animale si

immettono gli anticorpi del coniglio e vedo se ci sono risposte contro questo

anticorpo)

Rilevazione (perossidasi o fosfatasi alcalina) il colore è direttamente

proporzionale all’antigene.

LEZIONE 24 APRILE – ENZIMI 2

Misure discontinue -> costruisco per punti la curva di variazione (retta o curva

data da formazione nel tempo)

Enzimi e trasformazioni alimentari

Definire le condizioni di un trattamento da applicare per essere sicuro che

l’enzima sia inattivo.

Presenza di residui di protesosi che nel tempo portano a una idrolisi con

possibile formazione di un gel (fondo del latte UHT). Perché succede in un latte

sterilizzato e non pastorizzato? Perché la durata di shelf-life del latte

pastorizzato è minima e non riesco a veder queste manifestazioni.

Devo capire il tempo di trattamento e come modificare il processo per ridurre

questa attività proteolitica il più possibile (anche se un minimo rimarrà).

Lo stesso approccio predittivo vale anche per quando si raffredda, l’enzima

viene rallentato ( es alimento congelato per 2-3 mesi poi posso trovare delle

alterazioni).

In attivazione enzimatica è una curva esponenziale, messa in logaritmo per

farla diventare lineare.

Slide 4 Elaborazione di tipo matematica. Si definisce il tempo di dimezzamento

per ogni temperatura trattata è il tempo.

K’ si può calcolare dalla equazione (slide 5).

Equazione Arrenius analizza la velocità in funzione della temperatura. La

variazione della velocità di una reazione (sempre di tipo esponenziale)

direttamente proporzionale all’energia di attivazione rispetto R (costante gas) x

temperatura.

Y= log k e x= 1/T

Spesso per queste reazioni la dipendenza non è mai una retta ma è una

spezzata. Ha entro una certa temperatura una certa pendenza che poi cambia.

Quindi è importante non stare in temperature vicine alla discontinuità (perché

in cui punti la velocità con cui avviene non è così definita).

Slide7 La definizione della stabilità termica di un enzima dipende molto dalle

temperature. Nella prima parte l’enzima più stabile è quello con retta grigia

nella seconda parte quello con retta blu. Non è detto che quello con una

discontinuità sia più i meno stabile, dipende dell’enzima e dalla temperatura di

trattamento.

KIT ENZIMATICI PER METABOLITI

Utilizzo enzima come mezzo per riconoscere un determinato componente. In

una matrice complessa l’enzima entra e permette di trasformare in qualcosa

che io misuro SOLO il composto che interessa, non interessa la sua attività ma

la sua capacità di trasformazione. TUTTO il substrato deve essere trasformato

ma non si arriva mai al 100%.

Devo calibrare la quantità di enzima e del composto da cercare in modo che

l’equilibrio sia tutto spostato verso destra. Devo capire quanto devo Diouzier il

campione in modo che sia tutto trasformato in un prodotto quantificabile in un

tempo stabilito, la quantità di A a fine reazione dovrà essere trascurabile.

Slide 13. Il NAD si riduce -> a NADH che assorbe a 340nm

Il NAD dovrà essere in forte eccesso per non limitare la reazione e quindi aiuta

a spingere la reazione vestirsi destra.

Posso anche determinare l’ammoniaca (questa sarà una reazione di riduzione,

il NAD si ossida). Valuto la riduzione di assorbanza a 340 nm. Analisi fatta

nell’uovo perché l’ovoalbumina invecchiando rilascia ammoniaca.

Slide 16 L’enzima ausiliario utilizza il prodotto della prima reazione (non è

quantificabile) in un prodotto misurabile

La seconda reazione è per forza spostata verso destra.

Slide 18 formazione etanolo. La reazione è spostata verso sinistra, quindi per

spostarla a destra bisogna trasformare l’acetaldeide. I due enzimi lavorano

accoppiati. Man mano che l’acetaldeide si forma viene trasformata.

Slide 19. Si accoppia un enzima che trasforma il prodotto della prima reazione

in qualcosa che quantifico. In questo caso la reazione va subito verso destra

(non come prima).

Determinare glucosio e fruttosio:

Il glucosio può essere trasformato in gluconato per avere ossidazione del

NADPH con l’utilizzo di due enzimi -> esochinasi e G6P deidrogenasi

Ma L’esochinasi fosforila anche il fruttosio, ma poi il fruttosio 6 fosfato NON

REAGISCE con la deidrogenasi. Quindi qui misuro SOLO GLUCOSIO

Poi si aggiunge isomerasi che trasforma fruttosio in glucosio, quindi ora posso

determinare il FRUTTOSIO.

La fruttosidasi scinde il saccarosio e l’esochinasi fosforila tutto. Se questo

trattamento lo faccio dopo aver determinato fruttosio, la quantità di saccarosio

è il doppio.

Slide 24. Prima faccio lavorare la galattosidasi e poi aggiusto il pH perché gli

enzimi lavorano a pH diversi.

Slide 25. Determinazione amido totale: considero amido totale solo l’amido

aggredibile dalle a-amilasi, solo l’amido accessibile trattato in presenza di

acqua e 100 gradi. (Si rende accessibili alle a amilasi grazie al trattamento).

Fino a ottenere acqua ossigenata poi trattata con perossidasi per ottenere un

composto colorato.

Se la reazione viene fatta avvenire senza prima trattamento ottengo l’amido

danneggiato o gelatinizzato. Il granulo non è integro e si ha maggiore

possibilità di aggressione, per capire quanto può essere gelatinizzato l’amido.

LEZIONE 2 MAGGIO

Capire quale enzima utilizzare per ottenere una trasformazione o cosa devo

cambiare per far funzionare bene l’enzima.

Attività idrolitica= rottura del legame. Se il substrato sono le proteine l’enzima

viene definito proteasi ecc..

GLI ENZIMI PROTEOLITICI

Idrolizzano una proteina a livello del legame peptidico. Diversa classificazione

delle proteasi (per capire quanto è adatta a uno scopo).

Le proteasi possono essere esogene da aggiungere o intriseche e già presenti

nel materiale.

Prima classificazione: MODALITÀ DI AZIONE

- Endoproteasi: rottura legame interno -> la utilizzo quando ottengo una

frammentazione di peptidi con dimensioni varie, ottengo un idrolizzato

con vasta produzione di peptidi. Esempio trispina, chimo trispina e

pepsina.

- Esoproteasi rompe a partire dall’amminoacido N o C terminale. Quando

voglio eliminare aa che danno un sapore amaro. Esempio

carbossipeptidasi.

Seconda classificazione: SITO DI AZIONE

- Agisce su aa N terminale

- Agisce su aa C terminale

Si possono liberare residui caricati, per le C negativamente. Si hanno quindi

interazione di cariche tra i due frammenti. Questo discorso vale molto più per

le endoproteasi.

Terza classificazione: SPECIFICITÀ SUBSTRATO

- aa basici

- aa acidi

- aa idrofobici (prolinasi-> enzimi che agiscono sui residui di prolina molto

importante perché le sequenze tossiche per i celiaci contengono prolina)

Bromelaina, papaina sono molto aspecifici, proteasi che idrolizzano un po’

tutto, quindi mi aspetto una frammentazione elevata.

Classificazione: OPTIMUM PH E TEMPERATURA

- acida, basica neutra (come la bromelaina che avrà un’azione più

prolungata)

- Mesofile, termofile, ipertermofile

Classificazione: Enzima chiave nel SITO ATTIVO. Una zona del sito di

riconoscimento diverso dal sito catalitico dove avviene la reazione

dell’amminoacido. Se nel processo si danneggia un aa nel sito catalitico anche

se l’enzima ha riconosciuto il bersaglio non funzione. Gli aa cha e nel sito

catalitico sono SERINA, CISTEINA. Dato che sono le più comuni le proteasi

vengono anche dette SERINPROTEASI OSSIA PROTEASI CHE HA NEL SITO

CATALITICO UN RESIDUO DI SERINA.

Alcuni enzimi hanno bisogno di metalli ne sito catalitico. Dette metallo proteasi,

molto presenti nei vegetali. Quando si vuole recuperare l’enzima durante la

fermentazione agisco con agenti chelanti per bloccarli, altrimenti le proteasi

agiscono e idrolizzano le proteine.

Utilizzati come coadiuvanti di processo esempio per rendere più limpida la

birra, oppure per la produzione di birra gluten free (aggiunta di enzimi

deglutinanti). Oppure per disossare le carcasse, gli enzimi riescono a

recuperare la carne rimasta sulla carcassa poi utilizzata per un secondo fine.

Anche per modulare le proprietà delle farine o facilitare la produzione di

alimenti gluten free, alimenti analoghi alla carne.

La bromelaina e papaina vengono utilizzate per rendere la carne più tenera

(carne conservata a una temperatura molto bassa quindi l’enzima lavora poco).

Enzimi inseriti nelle spezie di marginatura della carne per velocizzare il

processo. Nelle salamoie es. per la bresaola vengono aggiunti un po’ di enzimi.

Recupero dei peptidi che danno il sentore di umani, si cercano miscele di

enzimi necessari per isolarli. Principalmente vengono estratti da legumi. Es dal

lievito ricavo delle proteine isolate e ricavo i peptidi che hanno il gusto umami.

Gli acidi nucleici vengono separati dalle proteine e idrolizzati fino a IMP.

TABELLA con tutte le proteasi (endo/eso o miscela) con optimum di

temperatura, velocità idrolisi (si ricava dalla pendenza dalla curva della attività)

e distribuzione (ossia quanto grandi diventano i peptidi più piccoli o di più

grandi dimensioni).

Proteasi che riduce sale= semplicemente la proteasi agisce in ambiente acido e

quindi maggiore controllo microbico; quindi, posso ridurre il quantitativo di sale.

ASPARAGINASI trasforma l’asparagina in acido aspartico. Con alte temperature

si può sviluppare acrilammide. Problema nei cibi fritti, biscotti integrali (perché

l’asparagina è presente principalmente nel tegumento esterno). Quindi farò

trattamenti specifici durante il processo, es. durante la pulizia delle patate.

Se metti enzima ma non si abbatte il contenuto di acrilammide è perché è

contenuto lievito chimico che già produce ammoniaca e sposta la reazione

verso i reagenti e non i prodotti. L’asparaginasi viene aggiunta con un po’ di

acqua (il quantitativo di acqua non deve essere troppo per evitare sviluppo

delle altre amilasi).

Modifica di un enzima per un determinato processo. Esempio termolisina e

subtilisina utilizzati in tutti i detergenti, sono termofile (devono resistere alle

temperature di lavaggio). La metionina poteva essere ossidata da