Biochimica delle trasformazioni alimentari

Biochimica delle trasformazioni alimentari

Proteine negli alimenti

Per poter determinare la quantità di proteine in un alimento i principali metodi sono:

• Determinare l'azoto totale e con delle conversioni si arriva alla quantità di proteine.
• Metodi che si basano su proprietà spettroscopiche (UV/NIR).
• Metodi che sfruttano le proprietà dei metalli di formare con le proteine dei complessi colorati.
• Metodi che danno composti colorati usando coloranti o metodi che sfruttano la capacità delle proteine di interagire con composti di natura non proteica e dare composti colorati come la derivatizzazione.

Determinazione dell'azoto totale

L'azoto totale si determina con un metodo che trasforma l'azoto presente nelle proteine in un composto che si va a misurare: si tratta del metodo di Kjeldahl che è un metodo ufficiale basato sul fatto che una proteina produce solfato di ammonio che in ambiente alcalino (NaOH) diventa ammoniaca e solfato di sodio; a questo punto, l'ammoniaca viene titolata e la quantità corrisponde all'azoto presente nella proteina di partenza. Si prende in considerazione tutto l'azoto proteico in ammoniaca, quindi è complessivo; i vantaggi sono che è un metodo ampiamente utilizzato e uno standard di riferimento nella pratica industriale e legale, è applicabile a qualsiasi tipo di materiale, è preciso e riproducibile.

Gli svantaggi sono che determina tutto l'azoto, quindi anche non proteico che deriva dalle basi azotate, da un acido nucleico, ammoniaca e urea; ad esempio, l'esametilentetrammina viene ottenuta dalla condensazione di formaldeide e ammoniaca è un composto tossico ed è stato scoperto che nel latte in polvere cinese aveva un altissimo contenuto proteico determinato con questo metodo ma si trattava di una frode perché era stata aggiunto questo composto. È stato scoperto con altri metodi e quindi la quantità elevata di azoto non era proteico.

Si determina l'azoto e con coefficienti tabulati per proteine animali/vegetali che trasformano l'azoto in azoto proteico; questi fattori sono stati fatti tenendo conto che le proteine hanno una diversa distribuzione degli amminoacidi e quindi i coefficienti tengono conto del contenuto di azoto in base alla composizione media delle proteine caratterizzanti di quel gruppo di alimenti (cereali, legumi, proteine animali ecc.).

Inoltre, è un metodo lungo e laborioso, è parzialmente automatizzabile e dal punto di vista ambientale richiede composti chimici che sono quindi un rischio, in più utilizza temperature relativamente elevate. Se negli alimenti sono presenti tanti altri composti azotati questi vengono considerati come azoto proteico.

Metodi alternativi per la determinazione delle proteine

• Basato sullo stesso principio è il metodo di Dumas che è spesso utilizzato: il campione viene ossidato con ossigeno ad alta temperatura in presenza di un gas carrier; in queste condizioni si rilasciano componenti del campione, quindi CO₂, acqua e azoto e questa miscela di gas passa attraverso colonne opportune che portano ad avere solo azoto che passa attraverso una colonna gas-cromatografica e il segnale detector viene convertito in azoto e poi in base a determinati standard di conversione si arriva all'azoto proteico. La liberazione di azoto viene fatta con l'ossidazione e anche in questo caso occorre un fattore di conversione.
• I vantaggi sono che è un metodo molto rapido (meno di 4 minuti), non richiede catalizzatori o acidi forti, è facile da usare e può essere automatizzato. Si ha un costo più elevato e lo svantaggio è che si considera tutto l'azoto. La quantità di campione richiesta è molto piccola e quindi ci può essere un problema di rappresentatività soprattutto se si ha a che fare con un campione eterogeneo. Ciascun tipo di proteina richiede un diverso fattore di conversione, in ragione della diversa composizione amminoacidica.

Questi sono i due principali metodi utilizzati per determinare l'azoto totale.

Metodi spettroscopici

• Ci sono poi metodi basati su misure di tipo spettroscopico: il metodo NIR è molto utilizzato per controlli rapidi di routine ed è basato sul vicino infrarosso che segue il visibile prima di avere le microonde; sopra i 200 nm si hanno i raggi x, tra 200 e 380 nm gli UV, poi il visibile e poi il NIR 800-2500 nm, il medio infrarosso fino a 250000 nm e infine le microonde (lontano infrarosso). Se si colpisce campione nella zona del vicino infrarosso si ottiene uno spettro che è la somma di una serie di vibrazioni che vengono prodotte quando vengono colpite le lunghezze d'onde dei gruppi chimici dei composti presenti nell'alimento.
• Questa tecnica in base all'assorbimento delle radiazioni comporta le vibrazioni di alcuni gruppi CH, NH, OH e quindi si ottiene uno spettro; per ottenere un'informazione si compara lo spettro con la somma dei diversi gruppi. Da una serie di spettri di riferimento rispetto all'alimento che interessa si fa un confronto e per vedere il contributo delle proteine si guardano i gruppi NH. Si fa una deconvoluzione per capire il contributo legato alle proteine facendo una retta di calibrazione; con un software opportuno grazie agli spettri si può risalire al contenuto di interesse. Sono metodologie sicure, rapide, non distruttive e non usano reagenti chimici, solventi o gas; sono adatti per più tipologie di campioni, non è richiesta una preparazione del campione, non esigono particolari abilità dell'operatore, si ha un'estrema velocità di analisi (1 min circa), sono adatti per campioni solidi, liquidi, semi-solidi. Il problema è la precisione e l'accuratezza, infatti sono metodologie usate per screening rapidi dove c'è un limite di tollerabilità; bisogna avere uno strumento diverso per ciascun materiale perché le rette di calibrazione cambiano e inoltre è chiesta una significativa quantità di campione.

Il Kjeldhal e Dumas sono tecniche distruttive, necessitano di una preparazione del campione e il tempo è molto più elevato in quanto si hanno 2-12 ore. Il metodo NIR è meno distruttivo, può essere applicato anche lungo la catena produttiva ed è molto rapido in quanto dura anche solo 20 secondi.

Metodo UV spettroscopico

Il metodo UV spettroscopico è un metodo basato sulla misurazione dell'assorbanza nella regione del UV; è una misura delle proteine partendo dal presupposto che alcuni amminoacidi se vengono colpiti dai raggi UV assorbono a 280 nm; è un metodo molto sensibile e discrimina le proteine rispetto ad altri componenti, come agli acidi nucleici perché questi hanno assorbanza a 260 nm. Alcuni amminoacidi, soprattutto aromatici e triptofano, tirosina assorbono a 280 nm e si può così misurare l'assorbanza della proteina perché di solito sono contenuti, altrimenti non si può usare questa tecnica.

Sfruttando questa proprietà è possibile determinare la concentrazione proteica di una proteina in quanto ogni proteina ha una sua estinzione molare che dipende dal contenuto complessivo di tirosina o triptofano. Da una misura di assorbanza totale si può risalire alla concentrazione della proteina presente. Se si guarda lo spettro si ha un massimo a 280 nm ma anche a 220 nm a causa del legame peptidico, quindi si hanno due massimi legati alle proteine. Questa è un'informazione importante perché dall'estinzione molare è possibile risalire alla concentrazione, con il legame peptidico è più difficile e quindi è un aspetto non praticabile, dice solo che si tratta di una proteina.

È un metodo molto rapido che consente di avere informazioni immediate, è molto sensibile e viene utilizzato facendo riferimento a proteine marker come l'albumina o la gliadina e quindi si utilizzano coefficienti equivalenti o equivalenti in triptofano in base alla composizione della proteina. A 280 nm bisogna far attenzione alla presenza di altri composti che possono assorbire ma il limite è che si ha bisogno che la soluzione sia solubile e limpida perché altrimenti si legge la torbidità; è un metodo molto utilizzato nei metodi di quantificazione ma il campione deve essere solubile e la soluzione deve essere limpida. Il coefficiente di estinzione molare della BSA è 7,6 che è un dato che è stato calcolato; se si ha una proteina costituita da una miscela è necessario usare un riferimento rispetto a una proteina comoda. Un utilizzo che viene fatto è per vedere i fattori di concentrazione quando si fa un'ultrafiltrazione misurando la densità ottica che se aumenta vuol dire che le proteine sono aumentate di concentrazione.

Metodi per complessazione con metalli

Ci sono poi metodi che sono in grado di complessare dei metalli, sono basati sulla proprietà delle proteine di complessare dei metalli e formare composti colorati che vengono quantificati.

• Il primo metodo è il Biureto dove tra due amminoacidi si forma un complesso colorato grazie all'inserimento del metallo; la colorazione ha un'assorbanza massima a 550 nm e maggiore è l'assorbanza maggiore è la quantità di proteina presente. Questo metodo ha il problema che soffre delle interferenze della matrice alimentare da parte di zuccheri, lipidi, detergenti, composti riducenti che non consentono la formazione del complesso colorato. Inoltre, è un metodo relativamente poco sensibile.
• Da questo principio c'è poi un altro metodo basato sulla capacità del rame di formare complessi rendendolo più sensibile: nel caso del Folin e Lowry si ha lo stesso principio con la differenza che il complesso che si forma viene poi ridotto da un reattivo che è costituito da reattivo fosfomolbdotugstato in maniera acida formando una colorazione blu-rosso che si legge a 750 nm. Il vantaggio rispetto al Biureto è che con questa reazione si aumenta la sensibilità ma vi è la stessa problematica di interferenza con i componenti dell'alimento e inoltre il reattivo è instabile, quindi occorre prepararlo al momento e ci possono essere problemi.
• L'ultimo metodo legato alla complessazione delle proteine del gruppo azotato con il rame è il BCA: è un metodo simile a Biureto con la differenza che invece che utilizzare per la riduzione un reattivo si usa un altro tipo di reattivo che è un acido in sale sodico BCA; dopo aver fatto il complesso con il Cu²⁺, il reattivo va a ridurre il rame a +1 e questo si lega con l'acido biciconidico e forma un complesso con 4 atomi di azoto del legame peptidico e il Cu¹⁺ che è un complesso colorato. Questo metodo è sensibile ma usa reattivi più stabili e più maneggevoli, però ha lo stesso problema con molecole che possono essere interferenti e il vantaggio è che si ha un composto colorato con assorbanza a 560 nm.

Questi metodi hanno come metallo il rame 2+ o 1+.

Metodi basati su coloranti

• Ci sono poi metodi che sfruttano la proprietà delle proteine di associarsi a dei coloranti: il più utilizzato è il dye-binding assays che usa un colorante specifico G-250; quando il colorante è in soluzione ha colorazione nerastra/marrone e quando si associa con la proteina passa a una colorazione blu. Questo perché l'interazione tra colorante e proteina determina uno shift ipercromico, ovvero c'è uno spostamento del massimo di assorbanza e quindi della sua colorazione. Aggiungendo quantità crescenti di proteine diminuisce il massimo a 450 nm e poi aumenta l'assorbanza nella zona di 600 nm, quindi diminuisce il colorante libero e aumenta il colorante che si lega alla proteina.
• Tra colorante e proteina ci sono interazioni deboli, prevalentemente idrofobiche ma anche elettrostatiche. Il metodo di Bradford utilizza questo colorante e viene usato molto per le matrici alimentari ed è possibile vedere un confronto con il metodo micro-BCA: nel pozzetto si ha la formazione di colore a parità di concentrazione e si nota che nelle prime tre file con il BCA sono poco colorate, mentre con il Bradford si ottiene una buona colorazione e questo significa che è molto più sensibile rispetto a BCA. Si nota però che oltre la quarta fila l'intensità rimane uguale, mentre con il BCA aumenta in modo proporzionale: questo significa che la scelta dipende dalla sensibilità e il Bradford a basse concentrazioni ha una risposta pronunciata e quindi è molto sensibile e poi raggiunge un plateau, quindi è molto sensibile ma con linearità molto limitate. Il metodo di Bradford funziona bene in condizioni di bassa concentrazione proteica. Nel caso del metodo BCA si ha una buona linearità ma una minore sensibilità e quando si hanno elevate concentrazioni si ha già una situazione di completa saturazione del sistema, ha una linearità molto più ampia ma a bassa concentrazione non si ha una buona sensibilità.

Metodi di derivatizzazione

L'ultimo metodo è quello in cui si ha il dosaggio delle proteine formando un legame covalente con un reattivo; quest'ultimo si lega al gruppo amminico N-terminale, quindi viene molto usato per la determinazione di amminoacidi/proteine. Quando si forma il legame, si forma una colorazione blu. Lo stesso principio lo usano altri composti come la fluorescamina che quando si lega fa un composto che diventa fluorescente e lo stesso discorso vale per l'o-ftaldeide. Gli amminoacidi e le proteine vengono rilevate nello stesso modo. Il metodo di derivatizzazione è sull'N terminale, quindi non distingue amminoacidi e proteine. I metodi colorimetrici funzionano se il campione non contiene agenti riducenti o detergenti perché si ha un'interferenza a causa del legame che si crea con il colorante; un detergente è in grado di formare un legame idrofobico con un colorante e quindi si ha un'interferenza, come anche per gli agenti riducenti perché interferiscono sull'ossidazione del rame che se non viene ridotto interferisce sulla reazione. Se si hanno detergenti si usa il BCA o il Bradford con detergenti in concentrazioni molto basse. La scelta del metodo è anche legata alla matrice complessa che si ha. Se si ha torbidità succede che si ha il rischio di leggerla e quindi questa può interferire sulla valutazione spettrofotometrica.

Accorgimenti operativi per la quantificazione delle proteine

Legata alla quantificazione si possono avere delle problematiche e per questo sono necessari accorgimenti operativi perché nella matrice alimentare sono presenti anche altri composti e quindi bisogna fare attenzione con la pre-preparazione del campione prima di fare la determinazione per essere sicuri di determinare solo le proteine.

Il primo aspetto è considerare la presenza altri componenti perfettamente solubili che possono reagire con il principio utilizzato per determinare la proteina, come composti che reagiscono con metalli o coloranti. Inoltre, si deve essere sicuri che si determinano proteine o peptidi o amminoacidi o altri composti azotati presenti. Ci sono diverse strategie ma la più pratica è il preparamento della matrice alimentare con acidi caotropi, ovvero si fa una precipitazione con acidi che sono sulfosalicilico, tricloroacetico e perclorico; questi acidi sono forti, hanno funzioni elettron-attrattrici, ovvero facilitano il distacco di un protone, sono poco solvatati e possono penetrare all'interno della struttura proteica e quindi modificano la struttura e ne determinano una variazione della loro solubilità, quindi precipitano la proteina. Questi acidi generano anioni poco solvatati, penetrano nella struttura e quindi distruggono le interazioni ioniche consentendo l'esposizione di superfici idrofobiche che tendono ad attrarsi tra di loro formando aggregati che poi precipitano; l'effetto del trattamento è di far precipitare le proteine e tutto il resto rimane solubile è costituito da tutti gli altri composti. Dopo di che, si fa la determinazione concentrazione proteica sulla fase precipitata contenente le proteine e avendo così solo il loro contributo.

Questi tre acidi caotropi formano degli anioni che sono presenti nella serie di Hofmeister che ordina gli anioni e cationi per l'affinità verso l'acqua e quindi sono considerati lipofili, sono instabili e facilitano la precipitazione delle proteine che vengono denaturate in quanto si rompono le coppie ioniche e vengono esposte le zone idrofobiche. Si ottiene un precipitato costituito da proteine. Questa strategia funziona meglio con una proteina con molti amminoacidi idrofobici, a concentrazioni elevate di proteine perché interviene il fattore di concentrazione, in assenza di detergenti e di altre sostanze come l'urea perché sono dei dissocianti delle interazioni idrofobiche. L'acido sulfosalicilico è tipicamente usato per separare le proteine in caso di campioni biologici in analisi cliniche; nel caso invece del TCA e perclorico sono usati nell'analisi alimentare perché sono più adatti. La formazione di questi aggregati dipende dalla superficie idrofobica esposta, quindi in base a livello di denaturazione che hanno gli acidi sulle proteine e questo aspetto viene sfruttato per fare una rimozione selettiva dalla soluzione di proteine e peptidi e anche in base alle dimensioni delle proteine: in una soluzione proteica si possono avere informazioni selettive in base alla dimensione delle proteine usando concentrazioni diverse dell'acido TCA.

Una concentrazione del 5% in peso g/g precipita prevalentemente le proteine che hanno un peso molecolare maggiore di 15000 Da, quindi si precipitano proteine “grosse”; con il 10% quelle che sono maggiori di 10000 Da, con il 15% maggiori di 5000 Da, con il 20% le proteine che rimangono in soluzione sono quelle che hanno PM minore di 3000 Da. In questo modo, con la precipitazione frazionata si ha anche la distribuzione relativa del tipo di proteine presenti in base alle dimensioni.