Biochimica

CO

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Molti enzimi, nel catalizzare un processo di reazione vanno a formare dei cosiddetti intermedi

covalenti, i quali nel proseguimento del processo verranno poi rotti per arrivare all’effettiva

sintesi dei prodotti. Per fare ciò , spesso gli enzimi vanno a esplicare la catalisi covalente di tipo

nucleo ilo, al ine di effettuare attacchi di tipo nucleo ilo. Esempi di gruppi presenti nella

struttura di un enzima che possono effettuare attacchi nucleo ili possono essere serina, gruppo

–OH legato a uno ione Zn , gruppo –SH della cisteina, il CO di un aspartato, o l’amminoacido

2+ 2–

istidina. Vediamo nella tabella seguente gli enzimi relativi a questi gruppi, e gli intermedi

covalenti che vanno a creare:

Un esempio di reazione catalitica in cui si ha la formazione di un intermedio covalente è quella

catalizzata dalle proteasi a serina, enzimi che degradano le proteine, rompendo il legame

peptidico che lega gli amminoacidi della catena polipeptidica. E_ un enzima che, grazie alla

presenza del gruppo –OH della serina, oltre a rompere legami ammidici, può idrolizzare anche

gli esteri.

Nel meccanismo, si ha quindi la formazione di un intermedio covalente, un acil-enzima (un acile

legato al sito attivo dell’enzima) in seguito alla fase di acilazione, alla quale segue una

deacilazione dopo l’intervento di una molecola di acqua, che permette l’effettiva idrolisi del

legame peptidico, oppure dell’estere. In particolare, la serina viene inizialmente deprotonata da

una base presente nell'enzima stesso ed è ora in grado di formare un complesso intermedio

attaccando il carbonio carbonilico del substrato, che è un’ammide o un estere, si forma quindi

un acil-enzima. Nella successiva fase di deacilazione interviene l'acqua, che scinde l'enzima

dall'acile e la porzione R-NH o R-O del substrato si allontana, poi acquista un H diventando

– – +

R-NH o R-OH, riformando l'enzima di partenza e acido carbossilico o ammina come prodotto.

2

A fare da base per sottrarre il protone alla serina è l'istidina, assistita dall'acido aspartico che

possiede un gruppo carbossilico dissociato a COO che stabilizza la carica positiva dell'istidina

–

(effetto Bohr). Si parla, perciò , di triade catalitica, formata da serina, istidina e aspartato, legati

tra di loro da legami a idrogeno, che permette la liberazione del protone del gruppo –OH della

serina. 101

Si hanno differenti tipologie di proteasi a serina, come ad esempio la chimotripsina, tripsina o

elastasi, che cambiano tra di loro per la variazione di speci icità per il substrato su cui agiscono.

Prendiamo in considerazione nel nostro studio la chimotripsina, enzima che rompe un legame

peptidico – idrolizza quindi il legame carboammidico tra un C=O e un N-H – quando legato al C

α

che porta il carbossile si ha un amminoacido ingombrante e idrofobico (come fenilalanina,

tirosina, triptofano, metionina…).

Al livello dell’enzima, si ha quindi una tasca idrofobica che permette di far alloggiare un

determinato substrato, ovvero l’amminoacido riconosciuto, e questo consente di catalizzare

l’idrolisi del legame peptidico. Oltre alla chimotripsina, che riconosce residui amminoacidi

ingombranti e idrofobici, altre proteasi a serina hanno una determinata speci icità per il

substrato: la tripsina riconosce i residui amminoacidici basici (es. residuo di Lys o di Arg,

riconosciuti nel sito attivo da un residuo carico negativamente di aspartato), mentre l’elastasi

riconosce residui amminoacidici di piccole dimensioni e quindi non ingombranti (es. Ala): si ha

quindi una tasca estremamente ridotta al livello del sito attivo (è più una depressione

strutturale che una vera e propria “tasca”). 102

Analizziamo il meccanismo della chimotripsina. La serina presente nel gruppo catalitico è un

alcol primario; quindi, non subito “pronto” a cedere un protone, per cui per permettere questo

fenomeno vengono in aiuto un residuo di His e uno di Asp (aspartato), che “assistono” la serina

nel cedere il protone dell’ossidrile (azione della triade catalitica). A questo punto, il doppietto

elettronico dell’ossigeno può effettuare un attacco nucleo ilo sul carbonio carbonilico, che passa

poi sull’azoto, e in ine, in seguito all’ingresso di un protone, si ha la liberazione del peptide che

porta il gruppo amminico e la formazione sull’enzima del complesso dell’intermedio covalente,

ossia l’acil-enzima (fase di acilazione). acil-enzima

Fase di acilazione

Vediamo, in dettaglio il meccanismo di azione della chimotripsina. Nella prima fase di

acilazione, l’atomo di ossigeno della catena laterale di Ser produce un attacco nucleo ilo sul

195

carbonio carbossilico del legame bersaglio, formando un complesso instabile denominato

intermedio tetraedrico. L’intermedio tetraedrico formato possiede una carica negativa formale

sull’ossigeno (ione alcossido) derivato dal gruppo carbonilico. Questa carica è stabilizzata da

interazioni con gruppi NH della proteina, presenti in un particolare sito detto “buca

dell’ossianione”. In questo modo si ha una stabilizzazione dell’intermedio, e questo consente il

proseguimento della catalisi. Se l’intermedio rompe il legame con la serina, si torna alla

situazione di partenza, mentre invece se rompe il legame con N o O, si ha la formazione

dell’acil-enzima. 103

Meccanismo dettagliato della chimotripsina 1

2

In questo caso consideriamo come amminoacido “ingombrante” la fenilalanina, che si inserisce

nella tasca del sito attivo dell’enzima all’inizio del processo. Nella prima fase di acilazione,

l’interazione tra Ser e His genera uno ione alcossido sulla Ser fortemente nucleo ilico; lo

195 57 195

ione attacca il gruppo carbonilico del peptide, formando un intermedio tetraedrico acil-enzima

(1). Si ha, inoltre, la formazione di una carica negativa a vita breve sull’ossigeno carbonilico del

substrato, stabilizzata da legami idrogeno nel buco ossianionico.

L’instabilità della carica negativa sull’ossigeno carbonilico del substrato porta al collasso

dell’intermedio tetraedrico: la riformazione di un doppio legame con il carbonio rimuove il

legame tra il carbonio e il gruppo amminico del legame peptidico, causandone la rottura. Il

gruppo amminico uscente viene protonato dall’His e ne viene facilitato il distacco. Si ha cosı̀

57

la formazione dell’intermedio covalente acil-enzima.

Una molecola di acqua in entrata viene deprotonata per catalisi basica generale, formando uno

ione ossidrilico fortemente nucleo ilico. L’attacco dell’ossidrile sul legame estere

dell’acil-enzima genera un secondo intermedio tetraedrico (2), con l’ossigeno che assume

nuovamente una carica negativa nel buco ossianionico. 104

La scissione dell’intermedio tetraedrico forma il secondo prodotto, un anione carbossilato, e

produce il distacco della Ser . In ine, l’allontanamento del secondo prodotto di reazione dal

195

sito attivo (il residuo carbossilico), ripristina l’enzima libero. A questo punto, il ciclo può

ricominciare, con l’inserimento nel sito attivo di un altro amminoacido, ingombrante e

idrofobico, per quanto riguarda la chimotripsina.

Vediamo sotto riportata la schematizzazione della buca dell’ossianione, la struttura

appartenente all’enzima che consente la stabilizzazione degli intermedi tetraedrici.

Ossigeno carico negativamente

(ossianione), stabilizzato da legami

a idrogeno di atomi di H legati ad

atomi di azoto della Ser e Gly

195 193

Dopo aver visto adesso il meccanismo della chimotripsina, che effettua una catalisi di tipo

nucleo ilo, analizziamo di seguito il meccanismo di una catalisi di tipo elettro ilo, con la

formazione di una base di Schiff. La base di Schiff si forma per la reazione di un composto

carbonilico con un composto che porta un gruppo amminico, con sostituzione del doppio

legame C=O con il doppio legame C=N.

A pH neutro, la base di Schiff può essere protonata, per favorire il rilascio di un protone, al ine

di formare una enammina (nel caso riportato, in cui abbiamo CH al posto di R’).

3 105

In generale, si ha la formazione di una base di Schiff in quanto il doppietto elettronico

disponibile sull’atomo di azoto dell’ammina va da attaccare il del legame fortemente

+

δ

polarizzato tra C=O (che possiede un sul carbonio e un sull’ossigeno), e cosı̀ si forma un

+ –

δ δ

intermedio tetraedrico. A questo punto entra un protone H , si ha un riarrangiamento di legami,

+

portando alla formazione di una molecola di acqua instabile, che si distacca dal composto (si

crea una carica positiva sull’ossigeno, stabilizzato dal movimento di un doppietto elettronico, e

questo determina il rilascio di una molecola di H O). Il doppietto elettronico spostato nel

2

passaggio precedente va cosı̀ a costituire il doppio legame C=N, lasciando una carica parziale

positiva sull’atomo di azoto. Nel passaggio inale, si ha il rilascio di un protone H , e cosı̀ si ha la

+

formazione di una base di Schiff.

–

δ

R O

δ

+

C

R 1

Numerosi enzimi utilizzano la base di Schiff nel processo di catalisi, come nel caso delle

transaminasi, le quali utilizzano il PLP (piridossal-fosfato) come cofattore, derivante dalla

vitamina B (può esistere come forma protonata dell’ossidrile, come in igura, o come forma

6

protonata dell’azoto N e deprotonata dell’ossigeno O ).

+ –

Vitamina B Piridossal-fosfato (PLP)

6 106

Vediamo quindi un esempio di transaminasi (reazione catalitica che prevede un passaggio con

formazione di una base di Schiff): analizziamo la α-amminoacido transaminasi, una reazione che

prevede il trasferimento di un gruppo amminico da un α-amminoacido su un α-chetoacido, con

formazione dell’amminoacido corrispondente al chetoacido, e formazione del chetoacido

corrispondete all’amminoacido di partenza. Il meccanismo di reazione può essere classi icato

come ping-pong (entra il primo substrato, esce il primo prodotto, entra il secondo substrato,

esce il secondo prodotto) e si ritrova in molte vie metaboliche, al ine di regolare il bilancio degli

amminoacidi.

Il primo passaggio della reazione è la formazione di una aldimmina interna, a causa del legame

del PLP con l’azoto di un residuo di Lys della catena polipeptidica, che crea cosı̀ una base di

Schiff interna. A questo punto entra il substrato, un altro amminoacido, e si forma la aldimmina

esterna, nel processo cosiddetto di transaldiminazione. Il passaggio iniziale della reazione che

prevede la formazione dell’aldimmina interna consente all’enzima di assicurarsi la presenza del

PLP, un cofattore molto versatile che può