Biochimica

FREEZING FRACTURE

L’analisi delle membrane delle cellule può essere svolta con diverse metodologie. Una

delle metodologie è quella che si chiama freezing fracture, che è un processo per il

quale si congela in maniera istantanea una cellula e poi tramite un bisturi” si riesce ad

aprire il doppio strato e a quel punto tramite microscopia elettronica a scansione,

ricoprendo questi strati con olio colloidale, si può vedere la topografia delle due

superfici e capire se ci sono proteine intrinseche di membrana, superficiali e cosi via.

Questa operazione vuole due condizioni:

1- che il cosiddetto freezing venga fatto in maniera istantanea

2-che nel processo di freezing non ci sia la cristallizzazione dell’acqua

Quando l’acqua in genere passa dallo stato liquido allo stato solido aumenta la sua

densità. ciò significa che la distanza tra gli ossigeni e gli idrogeni che costituiscono

l’acqua aumenta, questo comporta un aumento di volume, che in un processo di

freezing porterebbe a delle fratture sul sistema che si sta congelando.

Per evitare questo, il freezing delle cellule che devono essere poi aperte nel doppio

strato lipidico, viene fatto in quello che si chiama un bagno di ottano.

Un bagno di ottano consiste nel mettere in un contenitore dell’ottano, che è un

derivato del petrolio e ha un punto di congelamento di -112 gradi, e questo viene

messo in bagno in azoto liquido, che ha una temperatura di appena -142 gradi

centigradi. In queste condizioni nel momento in cui le cellule sono messe in questa

soluzione di ottano, gorgogliante si dice nel senso che è un ottano ancora allo stato

liquido ma sta quasi per congelare perché l’azoto liquido ovviamente ha una

temperatura più bassa di quella sua però prima di poter arrivare al di sotto di -112

gradi passa un po' di tempo, questo ci permette di “fotografare” una cellula nel suo

status vitale in una condizione di congelamento senza aver cristallizzato

assolutamente l’acqua perché non ha avuto materialmente il tempo di passare da uno

stato liquido a uno stato solido ma è diventata direttamente una condizione che l’ha

bloccata nella sua continuazione “di liquido”.

Questo ci permette tramite uno strumento da noi costruito di aprire le membrane e

poter fare poi questi esperimenti di microscopia per poter vedere materialmente come

è organizzata la struttura di membrana del doppio strato con proteine periferiche

transmembrana o integrali di membrana. Lo scalpello usato per aprire queste

membrane ha uno spessore di pochi micron come queste. Per far ciò si fila una

pasteur, ossia una pipetta di vetro sulla fiamma. Significa che si genera una fonte di

fiamma puntiforme e si fa riscaldare la pasteur su questa fiamma puntiforme sino a

quando è quasi alla fusione per cui si sfila e viene fuori un filo di vetro che ha lo

spessore minore di quello di un capello. In questo modo tramite questo scalpello

rudimentale si può entrare tra le due facce della membrana e aprirle per poterle poi

andare a colorare con i sistemi di colorazione di microscopia a scansione. Si usa

questo olio colloidale che formerà un film e quindi andrà a rappresentare tutte le

superfici della membrana e capiremo dalla complementarietà qual è l’organizzazione

delle proteine di quella membrana.

Ovviamente questa è una cosa abbastanza complicata, ci sono metodi molto più

semplici per capire se proteine di membrana sono proteine transmembrana o

periferiche di membrana e il modo più semplice è quello di usare due coloranti, uno

che si chiama Etilacetamide (EA) e l’altro che si chiama Isoetionilacetamide (IEA).

Mentre la molecola EA non riesce ad attraversare le membrane, l’IEA può

attraversarle. Onde per cui trattando una cellula con questi due coloranti avremo che

le proteine che sono esclusivamente estrinseche di membrana cioè che sono al di fuori

della cellula, saranno colorate esclusivamente del colore rosso dato dalla EA; quelle

che attraversano la membrana avranno un doppio colore che sarà violetto/rosso,

quelle che sono intrinseche di membrana ma che non attraversano la membrana ma

sono esclusivamente sulla faccia interna, saranno colorate soltanto dalla IEA e quindi

avranno colore violaceo/blu. Ovviamente queste proteine non le vediamo nel loro

posizionamento sulla membrana ma vengono estratte e separate su un gel

elettroforetico, che è una metodica che permette di separare le proteine secondo le

loro dimensioni molecolari e poterle vedere su una struttura gellificata di acitamide e

disatimamide(?).

DETERGENTI UTILIZZATI PER LA SOLUBILIZZAZIONE DI PROTEINE

INTRINSECHE DI MEMBRANA

Per estrarre le proteine dalle membrane, bisogna adottare degli accorgimenti nel

senso che essendo le proteine o legate o immerse nella membrana, hanno una loro

interazione con la componente lipidica e quindi idrofobica della membrana stessa. Per

questo per l’estrazione delle proteine, vengono utilizzati una serie di saponi che non

sono altro che molecole lipidiche. I saponi maggiormente utilizzati sono quelli che si

chiamano Octilglucoside, Sodium Colate e Triton. L’octilglucoside è una molecola molto

piccola quindi con questo tipo di sapone riusciremo a estrarre solo proteine che sono

ancorate con una coda lipidica alla membrana ma non proteine già integrate

all’interno della membrana. Per fare questo, se sono per esempio proteine che hanno

una faccia idrofobica e una polare, si utilizza il sodium colate. Questo ha una struttura

simile a quella del colesterolo e quindi si va a interporre nel doppio strato lipidico

andando a favorire una solubilizzazione però senza riuscire ad attraversare totalmente

il doppio strato lipidico. Quello che riesce invece ad attraversare perfettamente il

doppio strato lipidico è il triton. Di questo detergente esistono varie tipologie (Triton

x100, x114, x119, x134. Questo numero indica la lunghezza della catena carboniosa. A

seconda di quante volte una proteina attraversa una membrana si usano Triton di

diversa natura per andare a competere con la componente lipidica tra membrana e

quindi andarsi a mettere intorno alla nostra proteina che poi scivolerà fuori dalla

membrana perché si sono perse le interazioni idrofobiche tra i lipidi di membrana e la

proteina, proteina che ha preso contatti di tipo idrofobico con questi detergenti

noiomici e quindi può essere solubilizzata.

I lipidi di membrana possono organizzarsi in micelle o anche in strutture a doppio

strato e quindi quando usiamo i lipidi (?) possiamo o usare un unico strato e portare

all’interno di strutture tipo lisosomi molecole di tipo prettamente idrofobico oppure

sfruttiamo il doppio strato per portare all’interno molecole polari, perché avendo il

doppio strato questa parte interna sarà una parte idrosolubile e quindi potrebbe avere

componenti insolubilizzabili in acqua.

Dal punto di vista di funzione, le proteine di membrana hanno funzioni diverse: di

recettori, di lipasi (le lipasi sono enzimi che digeriscono i lipidi), le porine sono delle

strutture abbastanza complesse che permettono il passaggio di piccole molecole; o

funzioni trasportatrici di ioni ferro. Per es. la batteriorodopsina è una proteina che usa

la luce per pompare protoni (Questo di solito si trova in batteri fotosintetici).

A livello di membrana è presente un’asimmetria nella componente lipidica ma anche

nella componente proteica, in particolar modo nella componente delle glicoproteine o

proteoglicani che vanno a costituire componenti di membrana dove queste

glicoproteine/proteoglicani si trovano affacciati sempre verso la parte esterna. La parte

glucidica di questi elementi in genere ha una funzione di tipo recettoriale e quindi

permette l’appiccicamento almeno temporaneo di elementi che se trovano i loro

corrispettivi verranno captati o catturati da queste proteine che spesso sono proteine

che hanno funzione recettoriale e l’interazione molecola segnalatrice recettore potrà

trasdurre all’interno della cellula un segnale specifico.

Alcuni proteoglicani sono i Sindecani o gli Aggregani, tutti elementi misti proteina-

zuccheri che per la maggior parte hanno funzione di tipo recettoriale.

Come abbiamo detto a livello di membrana abbiamo un’asimmetria dove

fondamentalmente Fosfatidiletanolamina e Fosfatidilserina sono sempre affacciati

verso la parte interna della cellula, la Sfingomielina e la Fosfatilidcolina sono per lo più

esposti verso l’esterno della cellula, questa asimmetria è legata anche alla funzionalità

di questi diversi lipidi perché vedremo che in alcuni meccanismi di segnalazione su

una serie di lipidi vengono implicati per poter dire a una cellula quello che deve

materialmente fare.

La componente saccaridica quindi quella zuccherina è prevalentemente esposta verso

l’esterno della cellula e principalmente ha una funzione di tipo recettoriale.

Ovviamente le componenti proteiche sulla faccia interna ed esterna sono diverse.

Fondamentalmente le proteine che si affacciano all’esterno sono in genere proteine

transmembrana per cui hanno capacità di attraversare tutta la membrana e in qualche

modo hanno una porzione citosolica. Fra la porzione extracellulare e quella citosolica

c’è una funzionalità ben diversa: quella esterna è di tipo recettoriale. Una volta che si

ha l’interazione fra elemento segnalatore e proteina recettoriale, in genere questo si

perpetua in una modifica conformazionale della porzione citosolica per cui siti che

erano nascosti diventano accessibili a elementi o del citosol o elementi di membrana

che sono vicini al recettore. Questa espressione di questi siti di riconoscimento

permette un’interazione fra proteine diverse che segnaleranno un cambiamento che

può essere o un cambiamento di tipo metabolico se la via attivata è una via di tipo

metabolico o potrebbe essere un cambiamento addirittura funzionale, per es la via che

attivano i processi polifrazione cellulare o di motilità cellulare che sono sempre legati

comunque all’espressione di geni che modificano totalmente il fenotipo cellulare.

Movimenti della componente lipidica

La membrana è un sistema fluido e la fluidità è data fondamentalmente dalla capacità

di motilità sia della componente lipidica che di quella proteica. Partendo dalla

componente lipidica, esistono diversi tipi di movimento e i movimenti fra i lipidi sono

fondamentalmente di traslazione sulla superficie della membrana, di rotazione su loro

stessi per cambiare posizione ma esistono pure dei movimenti che sono molto lenti di

Flip-Flop in cui un lipide che si trova su una faccia della membrana si può ritrovare

sull’altra faccia della membrana. Esempio canonico di un movimento flip flop &egrav