Appunti per esame di Nanotecnologie per la bioingegneria

ICB

La terapia di blocco dei checkpoint immunitari è un tipo di immunoterapia che agisce

"sbloccando i freni" naturali del sistema immunitario. Le cellule tumorali spesso sfruttano

proteine chiamate "checkpoint immunitari" (es. PD-1, PD-L1, CTLA-4) per inviare segnali

"stop" ai linfociti T, le cellule immunitarie deputate a distruggere le cellule malate. Gli inibitori

dei checkpoint immunitari sono farmaci che bloccano queste interazioni, impedendo alle

cellule tumorali di disattivare i linfociti T.

Vaccino per il cancro

Il vaccino per il cancro (terapeutico) funziona "addestrando" il sistema immunitario del

paziente a riconoscere e attaccare le cellule tumorali. Contiene molecole (antigeni)

specifiche del tumore o le istruzioni (spesso mRNA) per produrle. In questo modo, i linfociti T

e altre cellule immunitarie imparano a identificare e distruggere selettivamente le cellule

malate, potenziando la risposta antitumorale del corpo.

Terapia CAR-T La terapia CAR-T è un'immunoterapia altamente

personalizzata. Si prelevano i linfociti T dal sangue

del paziente, si modificano geneticamente in

laboratorio per esprimere un "recettore chimerico

dell'antigene" (CAR). Questo recettore permette ai

linfociti T di riconoscere in modo specifico un

bersaglio presente sulle cellule tumorali. Una volta

reinfuse nel paziente, queste cellule CAR-T

"potenziate" possono individuare e distruggere le

cellule tumorali.

Ha ancora dei grossi limiti, costa tantissimo, bassa risposta terapeutica, è pericolosa ed

estremamente lunga.

Nano e micro fabbricazione

Creazione di strutture con dimensioni dal micrometro (10⁻⁶ m) al nanometro (10⁻⁹ m).

A livello tecnologico, la micro/nano fabbricazione è alla base della produzione di substrati

specializzati, realizzati tramite processi litografici, che trovano impiego in dispositivi avanzati

come Primo o JeWell. Un'altra area cruciale è la microfluidica, che permette la creazione di

sistemi miniaturizzati capaci di manipolare volumi infinitesimi di fluidi, ideali per lo screening

di farmaci o per analisi diagnostiche complesse su chip. Dal punto di vista biologico, queste

tecniche sono rivoluzionarie perché consentono di ricreare in vitro con estrema precisione le

condizioni che le cellule sperimentano in vivo. Questo è fondamentale per "dissezionare" e

combinare segnali ambientali specifici, stabilire saggi biologici più rilevanti e, in ultima

analisi, comprendere meglio le intricate interazioni tra le cellule e il loro microambiente.

Tra le tecniche di fabbricazione, la Litografia UV spicca per la sua importanza. Si tratta di un

processo fotolitografico che impiega la luce ultravioletta per trasferire un disegno predefinito

da una maschera (photomask) su un materiale fotosensibile chiamato resist. Il processo si

articola in diverse fasi: la generazione del pattern sulla maschera, l'applicazione del resist

(che può essere positivo, diventando solubile all'esposizione, o negativo, diventando

insolubile), l'esposizione alla luce UV attraverso la maschera per indurre modifiche chimiche

nel resist, e infine lo sviluppo, che rimuove selettivamente le aree esposte o non esposte,

rivelando il pattern desiderato sul substrato sottostante.

Accanto alla litografia UV, un'altra tecnica significativa è la Litografia a Impronta (Imprinting

Lithography). Che si divide in soft e nano imprinting.

La soft lithography è una tecnica di nanofabbricazione che impiega stampi elastici,

tipicamente in PDMS, per replicare un pattern.

Funzionamento: Un "master" rigido (con il pattern desiderato) viene usato per creare lo

stampo flessibile in PDMS, utilizzando spesso la UV lithography. Questo stampo in PDMS

viene poi utilizzato per "stampare" il pattern su un nuovo substrato. Ci sono diverse varianti:

• Microcontact Printing: Lo stampo in PDMS è "inchiostrato" e pressato sul substrato

per trasferire molecole.

• Replica Molding: Lo stampo in PDMS replica il pattern in un secondo polimero liquido

che poi solidifica.

• Microtransfer Molding: Il PDMS con canali riempiti di un precursore liquido viene

usato per trasferire il pattern sul substrato.

Vantaggi: Economica, flessibile (si adatta a superfici non piane), facile da usare e

compatibile con molti materiali.

Il nano imprinting è una tecnica che trasferisce un pattern da uno stampo rigido (es. silicio,

quarzo) su un sottile strato di polimero (resist) su un substrato, tramite deformazione fisica.

Funzionamento:

• Nanoimprinting Termico (T-NIL): Stampo e resist vengono riscaldati oltre la

temperatura di rammollimento del polimero. Lo stampo viene pressato sul resist,

deformandolo, poi il sistema viene raffreddato per fissare il pattern.

• Nanoimprinting UV (UV-NIL): Lo stampo trasparente ai raggi UV viene pressato su un

resist foto-polimerizzabile a temperatura ambiente. L'esposizione ai raggi UV solidifica

il resist, replicando il pattern.

Successivamente si rimuove lo strato residuo di resist tramite etching per esporre il substrato.

Vantaggi: Altissima risoluzione (fino a pochi nanometri), costo-efficacia per la produzione di

massa, alta produttività e riproducibilità.

Le applicazioni pratiche di queste tecniche sono varie ed esemplificative del loro potenziale.

Un esempio è la creazione di Adhesive Micropatterns e Micropillars.

I Micropillars sono strutture microscopiche, tipicamente cilindriche o colonnari, che si

elevano dalla superficie di un materiale. Possono essere realizzati in una vasta gamma di

materiali, come polimeri, silicio, metalli o ceramiche.

Come si realizzano: Spesso fabbricati utilizzando tecniche di litografia (come fotolitografia o

nanoimprinting) seguite da processi di etching (incisione) o deposizione, o anche tramite

tecniche di soft lithography come il replica molding.

Funzione/Applicazioni: La loro forma e disposizione creano proprietà superficiali uniche che

possono essere sfruttate in diverse applicazioni:

• Superfici super idrofobiche: Creando una struttura ruvida a livello microscopico e

nanoscopico, intrappolano l'aria e fanno sì che le gocce d'acqua scivolino via

facilmente.

• Filtrazione e separazione: Utilizzati in dispositivi microfluidici per separare cellule o

particelle di diverse dimensioni.

• Studi meccanici cellulari: Servono come substrati per studiare come le cellule

rispondono a stimoli meccanici (ad esempio, le forze esercitate dalle cellule sui

micropilastri possono essere misurate dalla loro flessione).

Gli Adhesive µpatterns si riferiscono a configurazioni precise e definite di regioni adesive (o

non adesive) su una superficie a scala microscopica.

Come si realizzano: Generalmente fabbricati utilizzando tecniche di soft lithography, come il

Microcontact printing. In questo caso, uno stampo in PDMS "inchiostrato" con molecole che

promuovono o inibiscono l'adesione, viene pressato sul substrato per trasferire il pattern.

Altre tecniche possono includere la fotolitografia o il nanoimprinting per definire aree

specifiche con differenti trattamenti superficiali.

Funzione/Applicazioni: La capacità di controllare l'adesione a livello microscopico è

fondamentale in diversi campi:

• Colture cellulari controllate: Permettono di guidare l'adesione e la crescita delle

cellule in configurazioni specifiche, utili per studiare la biologia cellulare, la

formazione di tessuti o lo screening di farmaci. Ad esempio, si possono creare "isole"

adesive per isolare singole cellule o raggruppamenti controllati.

• Biosensori e diagnostica: Per immobilizzare biomolecole (proteine, DNA) o cellule

solo in aree specifiche di un sensore, migliorando la specificità e la sensibilità.

• Dispositivi microfluidici: Per controllare il flusso di liquidi o l'interazione tra fluidi e

superfici.

PRIMO

Il dispositivo PRIMO di Alvéole è una piattaforma di fotopatterning senza maschera e senza

contatto che utilizza la proiezione UV per creare micro-ambienti cellulari controllati.

Permette di "disegnare" con estrema precisione pattern di proteine e biomolecole su

substrati di coltura, di microfabbricare strutture come microcanali o pozzetti complessi, e

di polimerizzare idrogel con forme e rigidità definite.

Queste capacità sono cruciali per i test in vitro, poiché consentono di mimare

accuratamente l'ambiente fisiologico dei tessuti, controllare il comportamento delle cellule

(es. forma, adesione, migrazione) e sviluppare modelli cellulari più realistici, come "organ-

on-a-chip" o colture di organoidi/sferoidi, migliorando la predittività della ricerca e dei test

farmacologici.

Nano fabbricazione a due fotoni

Si tratta di una metodologia di stampa 3D su scala sub-micron che ha rivoluzionato la

capacità di creare strutture complesse e dettagliate in tre dimensioni.

A differenza della litografia UV tradizionale che utilizza un singolo fotone per attivare un resist,

la TPF sfrutta un fenomeno ottico non lineare: l'assorbimento simultaneo di due fotoni a

bassa energia (lunghezza d'onda più lunga, generalmente nel vicino infrarosso) per

attivare una reazione chimica (polimerizzazione) in un punto specifico. Il punto chiave è che

l'assorbimento dei due fotoni avviene solo se l'intensità del laser è estremamente elevata e

solo in un volume molto piccolo (il "voxel") dove il fascio laser è focalizzato. Al di fuori di

questo punto focale, l'intensità è troppo bassa per innescare la reazione, lasciando il resto

del materiale non esposto. Questo permette una risoluzione 3D eccezionale, poiché solo il

volume desiderato viene polimerizzato. Spostando il punto focale del laser in tre dimensioni

all'interno di un resist liquido, è possibile "disegnare" strutture 3D arbitrarie con dettagli

nanometrici.

Per la TPF sono necessari:

Sorgente Laser: Solitamente laser a impulsi ultra-corti (femtosecondi), come i laser

• Ti:Sapphire o in fibra ottica, che emettono impulsi ad alta potenza.

Sistemi di Scansione: Galvanometri o stadi piezoelettrici che consentono di muovere

• il punto focale del laser con altissima precisione.

Obiettivi a Immersione: Obiettivi ad alta apertura numerica (NA) per focalizzare il

• laser in un volume estremamente piccolo.

Fotoiniziatori: Molecole che assorbono i due fotoni e innescano la polimerizzazione

• del resist. Sono progettati per avere una sezione d'urto di assorbimento a due fotoni

elevata.

Resist (Resine): Materiali polimerizzabili liquidi che solidificano sotto l'azione dei

• fotoiniziatori attivati. Possono essere acrilati o epossidici, e vengono scelti in base alle

proprietà meccaniche, biocompatibilità e trasparenza de