Appunti Microbiologia generale, alimentare e industriale

I VIRUS

Sono entità biologiche dotate di un genoma virale (DNA o RNA), non sono considerati

organismi viventi in quanto necessitano di un ospite per potersi replicare.

Batteri = micron 10^-6

Virus = nanometri 10?-9 capside,

Sono protetti da un involucro proteico chiamato composto da monomeri

proteici chiamate capsomeri, che racchiude al suo interno il genoma virale

envelope,

Esistono virus con una membrana estera in cui vengono esposte proteine

speci che che deriva dalla membrana cellulare delle cellule che il virus infetta.

Al suo interno si trova comunque il capside del virus con il materiale genetico.

Il virus non possiede citoplasma e membrane di rivestimento, in oltre non compie attività

enzimatiche.

Il materiale nucleico del virus contiene l’informazione necessaria alla sua replicazione, ma

deve utilizzare le attività sintetiche della cellula ospite.

fi fi fi ff

I virus esistono quindi in 2 stati: extracellulare ed intracellulare.

vironi particelle virali

Nel primo caso si parla di o

Il corpuscolo del virus è diviso in:

- Collare

- Tubo del Core

- Guaina della coda

- Setole

- Fibra della coda

Il virus agisce infettando cellule

ospiti attraverso strutture simili a

siringhe con il proprio materiale

genetico.

Anche i batteri possono subire

infezioni virali, i virus che attaccano

batteriofagi.

i batteri sono chiamati

ciclo litico

Il è il nome che prende il

ciclo riproduttivo di un virus.

È diviso in piu passaggi:

1) la particella virale interagisce e viene assorbita dalla cellula (se ostacolo ciò creo

resistenza virale)

2) Materiale genetico del virus viene iniettato.

Si formano inizialmente enzimi in grado di idrolizzare il DNA microbico.

3) Il DNA dell’ospite viene digerito, inattivando delle capacità che la cellula puo

manifestare dal punto di vista fenotipico

4) Il DNA virale si moltiplica, utilizzando il materiale derivante dall’ idrolisi del materiale

genetico della cellula ospite

5) L’ospite trascrive e traduce il materiale genetico fagico generando “proteine del fago”,

che si autoassemblano intorno al DNA virale per formare nuove particelle virale

6) Uscita dalla cellula ospite, che avviene grazie a 2 attività enzimatiche:

- Destrutturazione della membrana, creando dei buchi grazie alla proteina

“holina”

- Rottura della parete batterica, grazie alla proteina “peptoglicano idrolasi”

I virus che utilizzano questo processo per la propria replicazione sono chiamati Virus

Litici. ciclo lisogeno

Alcuni virus batteriofagi hanno un

Le fasi iniziali sono le stesse, ma invece di aver un idrolisi del DNA dell’ospite, si ha una

integrazione del DNA virale nel genoma batterico.

profago.

Il batteriofago in questa forma è chiamato

Il microrganismo si divide normalmente conservando il DNA virale, ma in determinate

condizioni il profago va ad excidersi, provocando nella cellula un ritorno del ciclo litico

(ma con già milioni di cellule infettate).

Il virus rimane quiescente no a che le condizioni ambientali fanno scatenare il

meccanismo di excissione.

L’interazione virus-batterio è molto speci ca.

Per contare i virus devo fornire delle cellule ospiti da infettare (per i batteriofagi il terreno

di coltura sara dato da batteri).

Uso terreno che consente la crescita della mia coltura microbica.

Si usa la conta vitale ma con UFP (unita formanti placca)

Se non ci sono virus avrò una crescita normale.

Se ho particella fagiche allora il terreno infetto subisce una lisi: il terreno da torbido

diventa nuovamente trasparente nella zona di attacco.

I metodi che utilizzano i batteri per difendersi dai batteriofagi sono:

- Ostacolare l’adsorbimento del virus tramite l’esposizione di polisaccaridi

- Degradare il materiale genetico del virus

Grazie a dei processi che portano all’aggiunta di un gruppo metile alle basi azotate del

materiale genetico microbico, ciò fa si che un enzima prodotto dal microbo stesso sia

in grado di degradare il DNA non mutilato (del virus)

MECCANISMI DI SCAMBIO GENETICO

Microganismi procarioti hanno solo riproduzione asessuata.

Microrganismi eucarioti possono avere una riproduzione asessuata e sessuata nel

momento in cui si formano dei gameti.

La riproduzione sessuata porta a una ricombinazione del patrimonio genetico, dando

origine a progenie con corredo cromosomico arricchito.

Questo arricchimento può avvenire anche nei microrganismi con riproduzione asessuata,

tramite due modi:

- Mutazioni, l’ambiente seleziona il mutante più e ciente

- Trasferimento genico orizzontale

Il trasferimento genico orizzontale è un meccanismo che consente il trasferimento tra due

cellule della stessa specie o specie / generi diversi.

Consiste in uno scambio di materiale genetico non proprio.

Nei batteri avviene attraverso 3 meccanismi distinti.

trasformazione

Il processo di consiste nell’aquisizione di DNA libro dall’ambiente, che

diventa parte integrante del genoma.

Questo DNA puo ad esempio essere rilasciato da animali morti post degradazione.

Il DNA ambientale è una molecola estremamente resistente e disponibile ad interagire con

delle cellule microbiche che si trovano in uno stato siologico ben preciso detto “stato di

competenza“. fi fi ffi fi

La cellula deve avere sulla super cie esterna delle proteine leganti il DNA che svolgono la

funzione di internalizzare la molecola.

Una volta all’interno può subire due destini:

- Viene degradato come se fosse DNA virale

- Viene integrato ed utilizzato dai batteri per sopravvivere alle condizioni di

quell’ambiente

coniugazione

La è un processo mediato da plasmidi coniugativi, e puo avvenire tra ceppi

della stessa specie o tra ceppi di specie e generi diversi.

È di uso sia nei GRAM+ che nei GRAM-

Sono necessarie 2 condizioni a nché si veri chi:

- Vicinanza sica

- Una delle due cellule deve contenere un plasmide di tipo coniugativo

Plasmide coniugativo: una molecola extracrosomale che possiede le informazioni

necessarie al suo trasferimento alla cellula ricevente.

Il processo è gestito interamente da questi plasmidi

A seguito della vicinanza si instaurano meccanismi, grazie al plasmide coniugativo, che

fanno in modo che ci sia una fusione delle membrane cellulari delle due cellule.

In una cellula possono essere presenti diversi plasmidi coniugativi e di diverse dimensioni.

Quello che si trasferisce è un singolo lamento di DNA, perché è su ciente per creare

una copia.

L’ambiente determinerà il successo dello sviluppo.

N.B. Viene trasferito il plasmide coniugativo

trasduzione

La è un meccanismo mediato da batteriofagi, entrano quindi in gioco i virus.

Essi trasportano pezzi di DNA batterico da una cellula all’altra.

A seconda del meccanismo si parla di:

- Trasduzione generalizzata, l’idrolisi del genoma batterico provoca frammenti che

possono venire internati nel capside insieme al DNA virale (con una frequenza

bassissima) Una volta che il virus neo formato infetterà un’altra cellula, inietterà anche il

materiale genetico del batterio

- Trasduzione specializzata, richiede l’integrazione del genoma virale nel cromosoma

batterico, viene e ettuata quindi solamente da virus lisogeni.

Il genoma virale viene iniettato nella cellula e si integra tra due geni.

Una volta che il DNA virale si excide puo portare via con se una porzione a monte o a

valle della regione di integrazione.

Si viene a creare un “virus chimera”, ovvero con materiale genetico estraneo e quindi

potenziato.

Quando il virus chimera andrà ad infettare una nuova cellula, inietterà anche la nuova

informazione.

ff fi ff ffi fi fi fi ffi

TASSONOMIA MICROBICA

Indicazioni su regole e strumenti per identi care e classi care i microrganismi, si

suddividono i viventi in:

DOMINIO Bacteria

PHYLUM Proteobacteria

CLASSE Gamma proteobacteria

ORDINE Enterobacteriales

FAMIGLIA Enterobacteriacee

GENERE Escherichia

SPECIE Coli

Il punto di riferimento per la nomenclatura dei procarioti è chiamato Manuale di Bergey

IL 16SS rRNA

È un componente del ribosoma procariotico utilizzato nella ricostruzione della logenesi.

È un gene molto piccolo, circa 1500 nucleotidi.

È un singolo lamento di rRNA, 5’-3’, che assume struttura secondaria estremamente

precisa e che è la stessa per tutti gli organismi viventi.

Alcune mutazioni avvengono nelle regioni de nite “loop”, dove non ci sono doppi legami,

e sono quelle che vanno a di erenziare tra di loro le specie.

Se confronto due microrganismi e le di erenze sono nelle regioni loop, allora da un punto

di vista logenetico non sono molto distanti.

Se confronto due microrganismi e le di erenza sono nelle regioni dei doppi legami, allora

da un punto di vista logenetico sono lontanissimi, in quanto sono mutazioni che

avvengono con una probabilità in nitamente bassa.

Si puo dividere la sequenza di questo gene in:

- Regioni Conservative, dove la sequenza è identica in tutti i batteri

- Regioni Semi-conservative, dove la sequenza è uguale tra batteri della stessa specie

- Regioni Variabili

fi fi fi ff fi ff

ff fi fi fi fi

IDENTIFICARE UN BATTERIO

Si parte da un campione ambientale e si coltiva in piastrina petri.

Studio poi una sola colonia in coltura pura ed estraggo il DNA attraverso rottura

meccanica o lisozima.

Elimino le proteine tramite proteasi e le faccio precipitare, mantengo quindi il DNA in

soluzione acquosa.

Viene fatto precipitare il DNA eliminando acqua di solvatazione, aggiungendo etanolo

reazione a catena della polimerasi (PCR),

Viene usata poi la che ci permette di ottenere

grosse quantità, in maniera selettiva, di un gene che ci interessa (16SS rRNA), e che viene

poi confrontato con le banche dati.

Per appartenere alla stessa specie tollerato il 2-3%, quindi se le sequenze sono uguali tra

loro tra il 97 ed il 100% siamo sicuri che appartengono alla stessa specie.

Per la PCR ci serviranno:

- Desossiribonucleotidi trifosfati da polimerizzare

- Il DNA deve essere denaturato

- Devono esserci gli inneschi, breve sequenza di DNA complementari alle estremità 5’ e

3’ dei frammenti da riprodurre

- Enzima “DNA polimerasi”

Metto tutto in una provetta ed inizio il processo:

1) Denaturazione termica a 95°C

2) Gli inneschi si attaccano uno a valle ed uno a monte del singolo lamento, in

corrispondenza del singolo lamento che voglio copiare.

Si agganciano riportando la T ai 55-65°C.

3) A T=72°C la polimerasi inizia a lavorare e, vedendo il substrato dato dagli inneschi,

inizia a sintetizzare il lamento di DNA, an