Appunti di microbiologia applicata

Appunti del corso di microbiologia applicata anno 2021-2022

Microbiologia generale

Sterilità e terreni

Sterilizzazione: distruzione di ogni microrganismo vivente (comprese le endospore di Bacillus Clostridium). In un laboratorio la sterilità deve essere assoluta:

• Operatore: l'operatore non deve contaminare l'alimento
• Strumenti: per garantire l'accuratezza dell'analisi effettuata
• Utilizzo di terreni di coltura sterili per coltivare i microrganismi dell'alimento

Lo strumento più efficace per sterilizzare è il calore: porta alla denaturazione delle proteine

Metodi di sterilizzazione

Autoclave

• Sterilizzazione mediata da calore umido: più efficace di quello secco perché conduce meglio il calore
• T e t più contenuti rispetto all'utilizzo del calore secco
• Funzionamento: dell'acqua distillata viene portata a T ebollizione, diventa vapore che esce dalle valvole e satura l'interno → aumenta la P ed aumenta la T (sovrapressione): si giunge alla T interna desiderata e può partire la sterilizzazione

I terreni, che devono garantire sterilità assoluta, vengono inseriti in autoclave rapporto di T-t diversi in funzione del tipo di coltura: sovrapressione di 1 atm = 121°C per tempo di 15 minuti (20 min x 3/4 atm = 116°C) (30 min x 1/2 atm = 111°C). Tempi maggiore e T e P minori per limitare danni a composti organici come imbrunimento o caramelizzazione (che sottrarrebbero zuccheri al terreno).

Sterilizzazione con calore secco

Es. bottiglie di vetro pirex con tappo in stufa sterilizzata a 180°C. Usata per valutazioni microbiologiche "esterne" al laboratorio, es. acqua di corrente.

Sterilizzazione per filtrazione

Con filtri con cut off di 0,45 micrometro:

• Diametro dei pori inferiore al diametro dei batteri

Per molecole termosensibili che non possono essere sterilizzate tramite calore come vitamine e antibiotici, che poi vengono assemblate, sempre garantendo la sterilità, al terreno.

Leggi che regolano la sterilizzazione

Tempo di riduzione decimale D: tempo necessario per inattivare il 90% (ridurre di 10 volte) della popolazione microbica ad una determinata T. Il tempo dipende dal tipo di microorganismo e dal tipo di matrice in cui si trova (es. spore: mo più termoresistenti).

Per misurare il tempo di riduzione decimale creo una sospensione a carica nota nella matrice, preparo dei campioni di aliquote diverse degli stessi microrganismi e le espongo a temperature diverse. Poi faccio un prelievo e conto MO mediante diluizione e piastramento o con citometria a flusso e uso questi dati per costruire delle rette. In questo modo trovo la temperatura più efficace per avere la riduzione della carica microbica in quella condizione log N/N0 = -t/D. D si ricava dalla Prima legge di Bigelow:

N0 Ne numero dei microrganismi al tempo iniziale e finale rispettivamente. t è il tempo di esposizione a quella determinata temperatura (log D1/D2 = T2-T1/z). Dalla seconda legge di Bigelow trovo il valore Z: aumento di temperatura che deve essere realizzato per ridurre il valore di D di un fattore 10.

Preparazione terreni - inoculo - osservazione

• Lavorare in sterilità

Ambiente sterile in laboratorio è ottenuto grazie alla fiamma del becco Bunsen:

• Fiamma gialla: riducente
• Fiamma blu: ossidante → più calda (genera intorno più caldo) e più stabile

Preparazione terreno di coltura: in beuta pesandolo e sciogliendolo in acqua, il terreno liquido poi viene inserito:

• Provette chiuse non ermeticamente (si aria, no contaminazione esterna)
• In piastre Petri: aggiungendo agar: non interferisce con le caratteristiche chimico fisiche del terreno, non interferisce a livello di nutrimenti, è inerte, si scioglie scaldando il terreno a 100°C, inizia a solidificare al di sotto dei 40°C e ciò consente di versarlo nella piastra Petri e poi farlo solidificare

Queste operazioni si fanno sopra becco Bunsen con fiamma ossidante per garantire la sterilità.

Tecniche di inoculo del campione

Piastramento per spatolamento o superficiale:

• In condizioni di sterilità, il campione viene depositato con una pipetta sterile, poi con una spatola si distribuisce la goccia di sospensione microbica su tutta la piastra in modo da occupare tutta la superficie possibile
• La parte liquida della sospensione viene assorbita dal terreno gelificato, le cellule si trattengono sulla parte solida del terreno
• Poi la piastra viene chiusa, capovolta e sottoposta a incubazione

Il quantitativo di campione da depositare è 0,1 mL (volumi superiori non verrebbero assorbiti e quindi si forma un film liquido sulla piastra). Contando le colonie e sapendo il volume iniziale risalgo al numero di microrganismi. L’incubazione (24/48 ore) viene fatta capovolgendo le piastre perché se non capovolgo si forma condensa che si accumula e gocciola sul terreno, invece capovolgendo l’umidità esce dai bordi; inoltre consente anche l’ingresso dell’aria. L'incubazione può essere fatta in ambiente aerobio o anaerobio.

Piastramento per inglobamento:

• Campione inoculato su piastra Petri vuota e sterile, dopo aggiungo il terreno agarizzato ancora liquido, mischio e lascio solidificare
• Il volume usato è maggiore (fino a 1 mL) perché non ho problemi di assorbimento sulla superficie
• Metodo usato per contare microrganismi sensibili all’ossigeno oppure perché la conta viene meglio se le loro cellule sono inglobate nella sospensione e non in superficie

Questi 2 metodi sono usati quando si vuole contare le UFC (conta vitale), in quanto permette di ottenere colonie ben separate e si utilizzano V noti.

Piastramento per striscio superficiale

Utilizzo di ansa sterile: strumento metallico con filo metallico usato per seminare il campione su piastra. Divisione ideale della piastra in 3 settori e senza mai sollevare la punta dell'ansa si eseguono 3 strisci a zig-zag sulla piastra:

• Il primo è a zig-zag con crescita contigua
• Il secondo diventa sempre meno fitto di unità
• Il terzo striscio, quello più diluito, prosegue a zig-zag, non con crescita confluente ma come singole unità

Quando si utilizzano colture microbiche o campioni biologici ad elevata carica di microrganismi si procede alla sterilizzazione dell’ansa prima di passare dal primo quadrante al successivo. Questo metodo serve a mettere in evidenza le colonie, ovvero per isolare/coltivare il MO, non a quantificarle, in quanto l'ansa non trasporta volumi definiti.

Osservazione colonie

Al termine dell'inoculo del campione di una comunità microbica (insieme di cellule che appartengono a specie e generi diversi), il risultato è una complessità di colonie di colore, dimensioni, lucentezza diverse… Le cellule che crescono e si sviluppano nel terreno, non sono tutte quelle presenti nel campione → motivi:

• Fattore principale: possibilità di crescere nel terreno preparato: dipende da:
  • Composizione del terreno (quali fonti di C, N, P…)
  • Presenza o meno di ossigeno
  • pH e T
  • Disponibilità sale
• Alcuni microrganismi competono sugli altri sul substrato e prendono il sopravvento
• Cellule microbiche possono produrre sostanze antimicrobiche: acidi organici, acqua ossigenata, antibiotici… che inibiscono la crescita di altri microrganismi

Problema: se il microrganismo è patogeno o sporigeno (clostridium difficiles) ma nel terreno non si sviluppa → non lo individuo. Di una colonia si descrive forma, spessore (piatto, sopraelevato, convesso, cupoliforme), colore, dimensioni, tipo di margine (regolare, ondulato, eroso, filamentoso, increspato) e superficie (liscia, opaca, lucida).

→ È difficile, solo osservando l'aspetto della colonia, risalire alla specie. Un'eccezione è rappresentata dal Bacillus mycoides: gram +, sporigeno, aerobio. Morfologia particolare: invade la superficie della piastra (microrganismo che cresce velocemente) formando ricciolini che ruotano in senso orario o antiorario.

Sviluppo della colonia

• La singola cellula di bacillus si divide senza separarsi → forma un unico filamento in cui si intravede i setti di separazione
• Le catenelle si allungano e da dei ripiegamenti, le cellule si duplicano creando altre catenelle
• Dopo 14-16 ore di incubazione si formano i ricciolini levogiri o destrogiri, dopo 72h la piastra è completamente invasa

Terreni di coltura

→ Substrato seleziona quali microrganismi crescono:

• Fonte di C: CO₂, metano, glucosio… MO che hanno sistema di trasporto ed enzimi per metabolizzare lo zucchero
• Fonte di N: ammoniaca, aa, proteine (MO con proteasi)…
• Sali minerali
• Vitamine
• pH
• Agenti selettivi di crescita di alcuni gruppi microbici es. antibiotici, sali biliari (enterobatteri che resistono), NaCl (seleziono osmofili)
• Indicatori di pH: per visualizzare se eventualmente le colonie hanno prodotto acidi organici, variando così il pH
• Agar: solidificare terreno per preparazione piastre petri

Inoltre si dovranno scegliere T e t di incubazione, aerobiosi o anaerobiosi.

Terreno di coltura per selezione di ceppi di Streptococcus thermophilus

Necessità:

• Saccarosio: idrolizza a fruttosio e glucosio
• Lattosio: utilizzo tramite sistema antiporto con uscita di glucosio (derivato dal lattosio) per fare fermentazione omolattica → si forma acido lattico che acidifica l'ambiente
• Urea: usa urea presente nel latte (è presente nelle secrezioni esocrine), grazie a sistema di trasporto ed enzima ureasi: idrolizza urea in CO₂ e 2NH₃ (ammonio) → usa ammoniaca come fonte di N e CO₂ per sintesi di aa e basi azotate.

NH₃+ in eccesso diffonde le membrane cellulari in quanto ha cariche ed alcalinizza il terreno di coltura. Simultaneamente il terreno viene acidificato (acido lattico) e alcalinizzato (ammoniaca) → parte dell'ammoniaca tampona l'acido lattico prodotto.

Come sviluppare terreno con queste caratteristiche:

• Latte in polvere magro ricostituito (no materia grassa che interferirebbe creando untuosità e viscosità): proteine e fonte di C
• Saccarosio: fonte di C
• Indicatori di pH che determinano variazione colore: verde di bromocresolo, rosso di bromocresolo
• La miscela di questi colori consente passaggio da giallo-verde a verde intenso in funzione pH
• Agar 15 g/L

Sterilizzo il terreno ed aggiungo urea (più del doppio di quella normalmente contenuta nel latte) → per amplificare l'effetto di alcalinizzazione, che rappresenta l'attività differenziale di Streptococcus thermophilus. La sterilizzazione tende ad idrolizzare termicamente la molecola di urea presente nel latte (termosensibile) rendendola non più disponibile all'idrolisi dell'ureasi.

Formula urea: NH₂-CO-NH₂

Semino ed osservo:

• Solo fermentazione omolattica (solo acidificazione) → diminuisce pH: viraggio verso il giallo (proporzionale al quantitativo di acido lattico prodotto). Le colonie appaiono tonde, traslucide e regolari
• Quando viene attivato dalle colonie il sistema di idrolisi dell'urea, il terreno vira al blu (neutralizzato acido lattico) → colonie biancastre su sfondo blu

Inizialmente il microrganismo cresce ed il metabolismo omofermentativo ha la meglio → colore giallo. Successivamente sposto la piastra dalla T di incubazione a 37° e la lascio a T ambiente → si interrompe la fermentazione omolattica del thermophilus in quanto termofilo, mentre l'attività ureasica continua → colore blu con colonie bianche.

Questo terreno mi permette di contare in modo differenziale in una popolazione mista di ceppi di streptococcus thermophilus quelli dotati di un’attività ureasi e quelli privi o con attività ureasica ridotta.

• Colonie di ceppo di ST con attività ureasica: blu
• Colonie di ceppo di ST senza attività ureasica: giallo
• Colonie di ceppo di ST con attività ureasica insieme a colonie prive di attività ureasica: distinguo colonie ureasi + (bianche) e colonie ureasi - (gialle)

Citometria a flusso

Metodo di conta diretta del numero di cellule in una sospensione. Cytometry: misurazione della cellula: concentrazione, dimensione, morfologia e complessità interna + altri parametri fisiologici (con uso di molecole fluorescenti): vitalità, danneggiamento membrana, potenziale di membrana, attività enzimatica. Si ottengono dati sulla totalità delle cellule, anche quelle morte. Flow: flusso: le cellule devono essere sospese in un fluido. Metodica indipendente dalla coltivabilità dei microrganismi nella sospensione. Migliaia di cellule al secondo passano una ad una attraverso uno o più raggi laser, e vengono misurate le luci deviate a diversi angoli e le emissioni di fluorescenza.

Composizione citometro a flusso

• Sistema fluidico: permette focalizzazione idrodinamica. Le cellule (evento) vengono incanalate in un'unica fila fino al punto di interrogazione: punto in cui incontra il raggio laser. Il liquido di trascinamento ha una P diversa da quella del campione: non si miscelano così riesce ad allineare gli eventi. In questo modo si analizza una singola cellula per volta.
• Fonte di eccitazione: laser luminoso a diverse lunghezze d'onda. Modo con cui cellula devia la luce è un parametro intrinseco:
  • Forward scatter: principio della diffrazione: dipende da come la luce viene deviata in avanti → direttamente proporzionale alle dimensioni della cellula
  • Side scatter SSC: come la luce viene deviata con un angolo di 90° → direttamente proporzionale alla complessità cellulare
• Sistema di filtri, lenti e specchi: che consentono la trasmissione della luce e della fluorescenza
• Detectors: rilevatori della fluorescenza e luce deviata del laser
• Sistema elettronico: converte il segnale ottico in segnale elettronico, che a sua volta viene digitalizzato, analizzato e convertito in grafico

La difficoltà è capire se nella popolazione di batteri c’è qualche background (granello di sale non disciolto, polvere, ecc.). Per capire ciò si ricorre alla marcatura con molecole fluorescenti: per discriminare quello che è cellula da quello che è un evento che ha deviato il raggio. Es. molecola fluorescente capace di intercalarsi nell'elica del DNA, come i marcatori molecole syto 24: cellule sono permeabili a questi marcatori senza pre trattamenti. La rilevazione della fluorescenza genera un impulso elettrico direttamente proporzionale ai marcatori fluorescenti, per cui usando contemporaneamente 2 molecole fluorescenti che hanno 2 canali di fluorescenza diversi, possiamo ottenere analisi informative dello stesso campione: uno per determinare il numero di cellule vive nel campione e l’altro numero di cellule morte e danneggiate.

Parametri valutati

• Basati su valutazione della deviazione della luce:
  • Natura della cellule
  • Proprietà di rifrazione: caratteristiche superficie e interne
  • Dimensione, ruvidità superficie, membrana cellulare, organelli
  • FSC: proporzionale alla dimensione
  • SSC: proporzionale alla complessità interna
• Basati su valutazione della fluorescenza: con più coloranti contemporaneamente:
  • Vitalità e funzionalità
  • Crescita
  • Attività metabolica
  • Integrità membrana
  • Potenziale di membrana (misura della salute del microrganismo, correlata alla formazione di ATP)

Applicazioni

• Controllo acque potabili
• Valutazione presenza di virus
• Microbiologia alimentare

Citometria a flusso vs HPC (heterotrophic plate count)

Quantificazione e determinazione vitalità di una biomassa microbica destinata alla formulazione di integratori a base di probiotici

Microrganismi probiotici: microrganismi vivi che se assunti donano benessere all'ospite. Le biomasse di microrganismi probiotici vengono prodotte, liofilizzate e introdotte nell'integratore. Fondamentale che rimangano vivi fino al termine della data di scadenza in etichetta. In commercio esistono formulazioni probiotiche che contengono diverse specie, 2/3 ceppi della stessa specie → È difficile trovare terreni selettivi per una specie. Metodiche che non si basano su coltivabilità delle cellule ma che si basano su approcci molecolari:

• PCR quantitativa (qPCR): consente di quantificare il numero di copie di DNA di un determinato organismo.