Microbiologia generale, alimentare e industriale

Microbiologia generale

Il microscopio

- Lenti: viene indicato il numero affiancato da una X (10X = 10 di oculare e quindi 100 di obbiettivo sempre 10 volte più grande).

- Obbiettivo: nei tubicini d'acciaio, portano sull'ingrandimento.

- Tavolino "mobile": dove si poggia il vetrino.

- Sorgente luminosa: attraverso tutti i sistemi ottici.

• Diaframma: lo si può chiudere o aprire in base a quanta luce si necessita.
• Condensatore: canalizza la luce in punto preciso.

Questa tipologia di microscopio permette di arrivare a circa 400 ingrandimenti. Per quanto riguarda l'apertura della lente vi sono due tipi di obbiettivi:

• Non immersione: tra vetro e lente passa dell'aria, gli obbiettivi hanno una distanza di lavoro maggiore.
• Immersione: necessitano di lavorare con olio minerale. Questo olio fa sì che l'obbiettivo non abbia continuità fisica con il vetrino e consente di utilizzare ingrandimenti maggiori, nonostante abbia lo stesso indice di rifrazione dell'aria; gli obbiettivi hanno una distanza di lavoro minore e quindi lavorano meglio ma a prezzi più elevati.

Il potere risolutivo viene indicato con la "d" ed è la capacità di distinguere due oggetti vicini tra loro. Più l'obbiettivo si avvicina al vetrino, più si ingrandisce il diaframma e quindi l'immagine sarà più grande (passa più luce) e viceversa. Il colorante crea una barriera al passaggio di luce; più l'oggetto è poco trasparente e minor varianza avrà l'onda di luce. Le tecniche di colorazione uccidono i microorganismi, impedendo la visione del movimento e quindi la loro mobilità. Per poterli vedere senza coloranti, è stata introdotta una tecnica di preparazione a fresco in contrasto di fase. In questo tipo di microscopio viene utilizzato il principio ottico:

- 2 onde luminose in fase somma per onda finale più luminosa.

- 2 onde luminose non in fase somma per onda finale buio.

Confronto tra microscopio ottico e in contrasto di fase

La luce arriva sempre dal basso ma il diaframma è anulare. Il condensatore è uguale e ha il compito di convogliare la luce nello stesso punto; i fasci laterali arrivano laterali al condensatore. Possono accadere due "cose" ai fasci:

• Non incontrano nulla durante il percorso e arrivano ai loro obiettivi, quindi non sono deviati.
• Subiscono una deviazione e dalla lente dell'obbiettivo vengono inviati verso la piastra di fase e nell'anello di fase. Maggiore è lo strato, dell'anello, da cui passano i fasci e maggiore sarà il ritardo di fase.

Si crea un ritardo tale che nella fase finale o si ha la massima luce o il buio. Questo microscopio è molto più delicato, rispetto a quello ottico, quindi un minimo disallineamento provoca un fuori fase e bisogna rimetterlo a posto il prima possibile. Esso non uccide i microorganismi perché non necessita di colorazione e permette una loro visione migliore.

Il microrganismo

È un organismo soprattutto unicellulare semplice per la struttura; complesso per la funzione. Esempi principali sono batteri, funghi, alghe e protozoi. I proteobacteria danno origine ai mitocondri mentre i cyanobacteria ai cloroplasti. Essi non hanno compartimentazione intracellulare; all'interno di una parete cellulare che riveste la membrana si trova il citoplasma in cui sono dispersi DNA e ribosomi. Il materiale genetico nei batteri è disperso nella cellula e non è visibile al microscopio ottico. Negli eucarioti è circondato da una membrana e forma un nucleo visibile chiaramente ed è nata grazie a processi di simbiosi tra un organismo procariote ed uno eucariote.

La dimensione del batterio è fondamentale per la filtrazione.

• Procariote
• Nucleo con membrana: No
• Cromosomi: Uno
• Meiosi: No
• Mitosi: No
• Riproduzione sessuata: No
• Mitocondri: No
• Cloroplasti: No
• Ribosomi: 70 S
• Eucariote
• Nucleo con membrana: Sì
• Cromosomi: 2 o più
• Meiosi: Sì
• Mitosi: Sì
• Riproduzione sessuata: Sì
• Mitocondri: Sì
• Cloroplasti: Sì
• Ribosomi: 80 S

Nell'ultimo caso S = coefficiente di sedimentazione, dove W è la velocità angolare del rotore, r è la distanza radiale della particella dell'asse e v è la velocità di sedimentazione. I procarioti in genere hanno un singolo cromosoma, non fanno meiosi e non hanno gameti; le cellule sono più piccole rispetto a quelle degli eucarioti, ordine di grandezza 10^-6 m. Questi hanno cellule più grandi e complesse grazie alla compartimentazione. I batteri possono essere classificati in base alle loro forme più comuni, ad esempio:

• Cocchi: forma sferica o ovale; si possono trovare in catenelle o in alcuni casi formano dei tetraedri; quando si dividono rimangono attaccati.
• Bastoncelli: lunghi o corti; si possono trovare in catenelle e la loro lunghezza ha un'importanza tecnologica.

Teoria endosimbiotica

La cellula eucariote deriva dalla fusione di un batterio con un'alga, simbiosi, ed uno dei due si è trasformato in un organello. Infatti, uno dei due DNA della cellula eucariote, il mitocondriale non il nucleare, assomiglia a un DNA batterico. Lo stesso discorso vale per le piante e il loro DNA del cloroplasto.

Le membrane cellulari

Le membrane cellulari separano l'interno e l'esterno della cellula, conferiscono individualità alla cellula e regolamentano gli scambi di essa con l'esterno. Esse sono costituite da un doppio strato fosfolipidico (fosfolipide testa idrofila, polare formata da molecola di D-glicerolo e 3-fosfato e code idrofobe, apolari composte da 2 molecole di acidi grassi non ramificati al -P legato al C3). Esse sono strutture di trasporto, solitamente delle proteine (catene di aa) che hanno rapporti con l'acqua differenti in base alla loro struttura e natura chimica. Per poter attraversare la membrana bisogna avere molecole anfipatiche, le molecole cariche non passano la membrana a meno che non ci sia un trasportatore destinato a questa funzione. Essa è tenuta insieme tramite legami deboli che la rendono fluida e dentro di esse galleggiano le proteine.

Le membrane dell'archea sono meno "fluide" e più rigide perché devono mantenere condizioni più estreme, quindi oltre ai fosfolipidi troviamo gli idrocarburi. Esse hanno una struttura loro:

• Il -P è esterificato con il C1 rendendolo L-glicerolo.
• Le catene degli acidi grassi sono sostituite da catene isoprenoidi, legati al glicerolo con legami esteri.
• Le catene sono formate da unità ripetute di isoprene che formano catene sature.
• I lipidi possono essere dieteri o tetraeteri del glicerolo; nel primo caso 2 catene alifatiche da 20 atomi di C sono legate a una molecola di glicerolo mentre nel secondo caso 2 lunghe catene alifatiche a 40 atomi di C sono legate fra loro e ciascuna alla sua estremità a 2 molecole di glicerolo. Il primo caso dà origine ad un doppio strato mentre il secondo a un mono strato e le membrane formate da questo sono quattro in totale, offrendo così maggiore resistenza alla separazione.

La membrana funge quindi da:

• Barriera permeabile: superficie attiva e selettiva per il trasporto di nutrienti e metaboliti nella cellula e fuori da essa.
• Sito di ancoraggio: di proteine coinvolte nel trasporto, nel metabolismo energetico e nella chemiotassi.
• Conservazione dell'energia: sito di generazione e mantenimento (protoni non entrano ed elettroni non escono). L'energia è utilizzata per tenere separate le cariche ed è presa dai nutrienti.

La membrana è una struttura di trasporto

• Diffusione:
  • Attraverso membrana.
  • Attraverso poro.
  • Facilitata o uniporto: trasporto di una specifica molecola.
• Trasporto secondario: (attivo) una non vincola l'altra.
  • Simporto: l'ingresso è facilitato dall'ingresso di un'altra molecola che si muove secondo gradiente (+ -).
  • Antiporto: l'ingresso è facilitato dall'uscita di un'altra molecola che si muove secondo gradiente; uno degli esempi di questo trasporto è quello del lattosio.
• Trasporto primario: ABC (ATP-bynding cassette) (attivo) in esso partecipano tre proteine: transmembrana, sopra la membrana e dentro la membrana. Esso è garantito dall'idrolisi di ATP che garantisce l'ingresso dello zucchero, il quale entra senza subire la fosforilazione. La proteina esterna alla membrana riconosce la sostanza da trasportare e la rilascia alla proteina transmembrana che funge da canale fino a quella associata alla membrana che lega ed idrolizza ATP.
• Traslocazione di gruppo: PEP-PTS (attivo) Una molecola esterna viene trasportata attraverso la membrana e contemporaneamente viene modificata chimicamente; si utilizza nei batteri per trasportare numerosi zuccheri che vengono fosforilati. PEP sta per fosfoenolpiruvato, ha un alto valore energetico che ha legato un gruppo fosfato e PTS sta per fosfotransferasico. Vi sono in totale 5 proteine consecutive: la proteina 1 riceve un gruppo -P dal PEP (intermedio della glicolisi) e lo cede alla 2 e viene così fatta una catena 1-2-3-4-5 detta fosfotransferasico che fa arrivare il -P fino alla proteina transmembrana 5 (PTS è il nome di questa sequenza di proteine). Quest'ultima trasloca il glucosio all'interno cedendogli il -P.

Un esempio è il lattosio: disaccaride formato da glucosio e galattosio, 2+ monosaccaridi esosi legati tra loro tramite condensazione. Gli ioni H entrano nella cellula secondo gradiente e trascinano con loro il lattosio (simporto). Nella cellula il lattosio viene scisso in galattosio e glucosio, tramite l'enzima beta-galattosilasi, il primo esce dalla cellula secondo un trasporto antiporto, esso esce ed entra altro lattosio, mentre il glucosio partecipa alla glicolisi e quindi al metabolismo. Il galattosio è più incline a creare legami quindi si imbrunisce prima. Permeasi è la proteina destinata al simporto-antiporto.

Le pareti cellulari

Le pareti cellulari sono strutture senza membrana che stanno "out" dalla cellula. Essa è rigida e garantisce resistenza, agli stress osmotici, e la forma tipica. Le proteine che sono situate sopra la membrana della parete in modo omogeneo sono dette surface layer, ricoprono circa il 30% della superficie totale ma di esse ancora non si conosce la funzione, si pensa che esse interagiscono con il sistema immunitario. I batteri hanno una parete cellulare e in base alla struttura sono divisi in:

• Gram-positivi: parete monostrato, di densità uniforme e formata da peptidoglicani; oltre a questi troviamo altre molecole come acidi teicoici, lipoteicoici e teicuronici; i primi sono i più presenti e in generale sono polimeri secondari, possono trovarsi legati solo al peptidoglicano o arrivare fino alla membrana. Essi possono trovarsi associati anche a proteine e dal punto di vista finale contribuiscono a definire le caratteristiche chimiche-fisiche della parete.
• Gram-negativi: parete a doppio strato, formato da uno strato sottile di peptidoglicano e da una membrana esterna che ha una struttura simile a quella della membrana cellulare. La membrana esterna perde la simmetria della membrana cellulare in quanto la parete esterna contiene i lipopolisaccaridi (LPS) oltre ai tipici fosfolipidi. I primi sporgono verso l'esterno e sono fondamentali perché sono riconosciuti dal sistema immunitario. Il LPS è una grande molecola anfipatica composta da tre porzioni:
  • Core: porzione idrofila della molecola e può essere diviso in interno ed esterno.
  • Antigene O: è un oligosaccaride in grado di indurre la produzione di anticorpi se si trova in un organismo; regione esterna che può essere diversa tra individui della stessa specie; caratterizza i diversi ceppi.
  • Lipide A: costituito da un dimero di N-Acetil-glicosamina esterificato con due residui fosfato e un numero variabile di acidi grassi.

Il "negativo" e "positivo" è detto in base a come reagiscono alla colorazione. In entrambi i casi abbiamo parlato dei peptidoglicani (aa + zuccheri). Essi sono composti da catene di polisaccaridi regolari, ovvero hanno un'alternanza di due amminozuccheri: NAG E NAM (N-acetil-glucosammina e Acido-N-Acetil-muramico). I legami che tengono agganciate queste catene sono peptidici (covalenti) e molto difficili da rompere o idrolizzare; solo particolari enzimi riescono a fare ciò e sono i lisozimi o le proteasi.

La colorazione di Gram

• Colorazione primaria: preparare uno striscio del batterio e trattare la cristal-violetto; sia gram-positivi che negativi si colorano di violetto.
• Mordente: coprire il preparato con soluzione di ioduro di potassio e iodio che si complessa sia con il cristal-violetto che con il materiale cellulare.
• Decolorazione: aggiungo allo striscio colorato gocce di etanolo (disidrata); il colorante viene lavato via in quelli negativi mentre in quelli positivi rimane in parte assorbito.
• Colorazione di contrasto: tratto il preparato con sofranina; quelli negativi sono di color rosso e quelli positivi violetti.

N.B: Dopo aver usato l'etanolo, idrato con l'acqua perché esso disidrata.

La lisi cellulare

I lisozimi sono prodotti dall'uomo (saliva, lacrima, latte, uovo) e rompono nello specifico il legame beta-1,4-glicosidico; se si parla di ambiente ipotonico questo enzima attaccando una cellula batterica ne degrada la parete e questa finirà per esplodere perché l'acqua che entra la fa gonfiare visto che la cellula è al suo interno ipertonica rispetto all'ambiente in cui si trova. Mentre se si parla di ambiente isotonico o fisiologico, il lisozima rimuove la parete ma la cellula non si rompe e diventa un protoplasto. In campo alimentare l'attività di questo enzima è sfruttata per evitare la proliferazione di MO; i clostridi sono dei batteri sporigeni che fanno gonfiare i formaggi fino a spaccarli a causa della CO₂ prodotta. Le cellule morte non per forza vanno incontro a questo processo; per far sì che la cellula non scoppi bisogna mantenere una soluzione isotonica (stessa pressione interna ed esterna).

Come si costruisce la parete cellulare? Vengono costruiti dei monomeri nella cellula che vengono portati fuori per costruire la parete. Esso è legato a una molecola ed è costituito da NAM + la catena peptica; insieme formano un blocco polare che non passa la membrana; proprio per questo è legato alla molecola che consente il passaggio del precursore della parete attraverso la membrana all'esterno. Questa molecola rende il blocco permeabile.

Differenza tra parmigiano e grana: nel primo caso non è permesso l'uso del lisozima perché non strettamente necessario; le vacche sono alimentate con solo formaggi freschi, non soggetti all'attacco di clostridi. Nel grana è permesso il loro uso poiché alle vacche vengono somministrati insilati in inverno che sono molto soggetti all'attacco dei clostridi. I batteri non patogeni possono essere "probiotici" e riescono a trasferire le proprie caratteristiche ad altri organismi, rischiando di rendere microrganismi patogeni resistenti agli antibiotici e rendendoli così pericolosi per l'uomo.

Gli antibiotici agiscono sulla parete batterica inibendo la sintesi dei peptidoglicano in uno dei tre comparti di formazione della parete: nel citoplasma avviene la sintesi dei precursori, a livello della membrana si ha la sintesi dell'unità monomerica e nello spazio esterno avviene la polimerizzazione e la trasnpeptidasi: ogni antibiotico è mirato su una specifica funzione della cellula batterica e funzionano su MO in crescita che sviluppano appunto la parete. L'antibiotico riduce i MO ad un numero tale che il nostro corpo è in grado di combattere. I prodotti per creare ambienti selettivi, esempio candeggina, non sono selettivi su batteri specifici ed eliminano tutto.

Nutrizione e crescita microbica

Nella fase di accrescimento le cellule dei MO necessitano di nutrienti, ovvero di molecole da assumere e utilizzare per la sintesi dei vari componenti cellulari. La conoscenza della composizione chimica della cellula permette di capire quali sono le sue esigenze. Se eseguiremo l'analisi di una cellula disidratata troveremo che è costituita da un numero limitato di elementi chimici che dovranno essere presenti nei composti che costituiscono un terreno adatto per la crescita batterica: in ordine di importanza sono Carbonio, Ossigeno, Azoto, Idrogeno, Fosforo, Zolfo che sono presenti al 95% sul peso secco e K, Na, Mg, Ca, Cl, Fe che invece costituiscono il 5% del peso secco presenti in macronutrienti.

Formula ionica entrambe le "categorie" sono.

Il Carbonio (C) è il componente più abbondante in assoluto e pertanto il più importante nella crescita dei batteri, una volta assunto viene espulso sotto forma di CH₂O. Oltre a fonte di C la cellula necessita anche di una fonte di energia che può essere luminosa o chimica.

La classificazione in base a come immagazzinano energia:

• Fotoautotrofi: per poter crescere necessitano di luce e usano la CO₂ come fonte di C.
• Fotoeterotrofi: ricavano energia dalla luce e la CO₂ è la fonte di C, insieme anche alla sostanza organica e le vitamine.
• Chemio-autotrofi: ricavano energia dall'ossidazione di sostanze inorganiche e usano come fonte di C la CO₂.
• Chemio-eterotrofi: utilizzano molecole organiche sia come fonte di C che di energia.

La colonia è un insieme di batteri che si possono vedere sulla scatola "Petri", in cui terreno di coltura.