Appunti di Patologia generale e immunologia, modulo oncologia

RUOLO DI P53 NEL MANTENIMENTO DELL’INTEGRITÀ DEL GENOMA

Quando il DNA delle cellule è danneggiato abbiamo il blocco del ciclo cellulare, riparazione e apoptosi. p53 è in grado

di attivare queste 3 funzioni in contemporanea. È un gene molto importante perché va a controllare i 3 eventi

essenziali che vengono poi persi durante la trasformazione neoplastica o eventualmente la progressione neoplastica.

p53 può essere attivato in seguito a due eventi (importanti poi nella formazione neoplastica):

• danno al DNA

• ipossia 44

Essendo un fattore trascrizionale, trasloca al

nucleo, tetramerizza, lega il DNA e attiva la

trascrizione di geni per il blocco del ciclo

p21,

cellulare, tra cui un inibitore delle CDK

(chinasi ciclina-dipendenti).

Avviene la trascrizione p21, che lega le CDK e in

qualunque punto del ciclo cellulare ci troviamo

ne blocca la funzione, per cui le CDK non

funzionano più → Rb non è più fosforilato, si

riaggancia a E2F e blocca il ciclo cellulare. Ciò

avviene principalmente in G1 ma anche più

avanti: p53 controlla tutto il ciclo tranne la

formazione del fuso mitotico.

Contemporaneamente, p53 attiva una serie di GADD45.

geni di riparazione, che in parte si attivano da soli: uno dei geni target è Quindi, il blocco cellulare dà alla

cellula il tempo di riparare il DNA.

Quando p53 non sente più il danno al DNA (perché tutto è andato bene ed è stato riparato), viene eliminato. A questo

punto p21 non viene piu trascritto e il ciclo cellulare riprende.

Se non si riesce a riparare il danno al DNA (perché molto forte), permane il blocco del ciclo cellulare e p53 trascrive

geni che determinano l’ingresso di cellula in apoptosi e in parte inibisce i geni anti-apoptotici. Un importante gene

BAX,

pro-apoptotico è una proteina che forma i pori nella membrana mitocondriale da cui esce citocromo C (apoptosi

di tipo mitocondriale) → la cellula inizia la cascata delle caspasi ed eventualmente va in contro a morte. Tutto questo

accade in una cellula sana.

In una cellula trasformata in senso neoplastico, se stimolata da agenti mutageni o più frequentemente se sottoposta

al processo di instabilità genetica, quindi acquisisce mutazioni spontaneamente → p53 può essere mutato (o è mutato

ciò che lo attiva).

Se c’è un danno al DNA, ma p53 è INATTIVATO, la cellula non blocca il ciclo cellulare, non viene riparato il DNA e non

abbiamo nemmeno l’ultima via d’uscita che è l’attivazione dei geni per l’apoptosi. Questo comporta l’espansione di

cellule mutate a causa della prima cellula mutata che ha acquisito un’instabilità genetica.

La mutazione si fissa nelle cellule figlie: l’instabilità genetica costante determina la continua acquisizione delle

mutazioni. L’instabilità genetica è un fattore importante per la proliferazione tumorale. Quindi l’assenza di p53 è un

aiuto alla progressione neoplastica. Ecco perché i tumori a volte perdono addirittura l’intero braccio del cromosoma

17 (che porta p53). p53 è perso con frequenza elevata perché regola molte funzioni: è il gene più mutato in assoluto

nei tumori! p53 non è l’unico oncosoppressore che regola questi fattori, ma li regola tutti, per cui perderlo è un buon

supporto per una cellula neoplastica.

Oltre a p53, c’è anche una modalità epigenetica per il controllo della proliferazione: trascrizione di miRNA-34 che

inibisce la traduzione di fattori come myc o CDK4, essenziali per la proliferazione e anche la traduzione di geni come

BCL2, con effetto anti-apoptotico. 45

LA REGOLAZIONE DI P53

È molto complicata perché deve sentire segnalazioni che arrivano da

più parti e deve avere un controllo molto fine.

p53 viene attivato da un danno genotossico, che viene trasmesso a

chinasi ATM e ATR,

p53 dalle sensori cellulari che sentono il danno

genotossico e lo passano a p53, fosforilandolo o alle chinasi del check

CHK2 e CHK1,

point, che vengono fosforilate e, a loro volta, passano la

fosforilazione a p53.

La fosforilazione di p53 lo stabilizza e quindi p53 si accumula nella

cellula, per questo lo vediamo accumulato nella cellula tumorale, che

è sottoposta costantemente a danno genotossico.

p53 fosforilato si accumula, va nel nucleo, funziona come tetramero e inizia a trascrivere i suoi geni target, cioè geni

importanti nel controllo del ciclo cellulare e nella riparazione del DNA. Poi controlla l’espressione di geni legati alla

senescenza e gene coinvolti nell’apoptosi. Quindi trascrive questi geni in sequenza e permette o la riparazione del

DNA o, alternativamente, induce l’apoptosi.

I livelli di p53, all’interno di una cellula sana (non sottoposta a danno genotossico), vengono costantemente

controllati: p53 viene trascritto e ubiquitinato grazie all’interazione con 2 proteine, MDM2 e MDM4, delle ubiquitin-

ligasi che determinano l’ubiquitinazione e la degradazione nel proteasoma. Questo avviene quando la cellula sta bene,

quindi p53 non si accumula, ma viene degradato. Per questo motivo si è pensato che p53 fosse un oncogene (perché

presente in basse quantità nelle cellule sane e alte quantità in cellule tumorali).

ATM, ATR e le checkpoint chinasi, una volta attivate dal danno genotossico, vanno ad inibire anche questa via; quindi,

nel momento in cui MDM2 e MDM4 non attivano piu l’ubiquitinazione di p53, questo viene stabilizzato e attivato. A

questo punto tetramerizza, va al nucleo e trascrive una serie di geni come i geni pro apoptotici (in giallo): PUMA,

NOXA E BAX, poi p21 (in arancione) oppure geni per la riparazione del DNA (in viola). Questo è un sistema di controllo

che permette alla cellula senza DNA danneggiato di avere dei livelli di p53 bassi perché costantemente degradato;

mentre una cellula sottoposta a danno genotossico (cellula instabile) ha una p53 che tende ad accumularsi e frenare la

proliferazione. Ovviamente, se p53 è mutato determinerà una mancanza di funzionalità.

In questo sistema intervengono vari elementi. Se MDM2 si lega a p53 lo fa degradare uno degli elementi che

à

impediscono la funzione di MDM2 è la fosforilazione di p53. Ci sono altri elementi che la inibiscono, come le chinasi

del checkpoint, ma anche il fatto che per l’attivazione degli oncogeni (come Myc o Ras o altri che inducono iper-

proliferazione) abbiamo l’ingresso nel ciclo cellulare, in cui viene anche attivato un elemento di freno del controllo,

ARF

chiamato chiamato anche p14 ARF, anche se la forma umana è una p19 (chiamiamo le proteine p + un numero

à

perché è il PM indentificato con western blot ed espresso in kDa, che non corrisponde per forza al vero PM). La

proteina ARF ha il compito di sequestrare MDM2, che non ubiquitina più p53, che si attiva, va nel nucleo e blocca il

ciclo cellulare. Se la cosa è prolungata, addirittura induce apoptosi motivo per cui molto spesso un’iper-attivazione

à

di oncogeni determina apoptosi, perché la cellula ha dei sistemi di salvataggio. Questo è uno dei motivi per cui, per

esempio, anche quando myc è iperattivo può causare apoptosi. 46

FEEDBACK NEGATIVO DI P53

1. A priori esiste una sorta di feedback negativo

di p53: quando p53 viene trascritto, lo stesso p53

va a legarsi a MDM2 e viene degradato: tutto

funziona in automatico.

2Pertanto, finché p53 non viene degradato e può

funzionare, attiva lui stesso la produzione di

MDM2 e di conseguenza abbiamo una sorta di

p53 che autoregola i propri livelli mantenendoli

bassi man mano che viene trascritto, a meno che

non intervengano fattori che lo stabilizzino.

2. Se viene stabilizzato, non va più a legare MDM2 perché la stabilizzazione determina mancanza di capacità di legame

con MDM2.

4. MDM2 può essere sequestrato a livello dei nucleoli da parte di ARF e, a questo punto, non abbiamo più

degradazione nel proteasoma e p53 si accumula: può andare ad agire anche trascrivendo i geni target che bloccano il

ciclo, che attivano riparazione del DNA e che bloccano apoptosi. Solitamente, i feedback negativi sono più pericolosi

negli oncogeni, ma qui lo vediamo con un oncosoppressore.

I SEGNALI MITOGENI MEDIATI DA AKT REGOLANO NEGATIVAMENTE P53

L’ultimo livello di regolazione di p53 è determinato dai segnali mitogeni.

Quando la cellula non è sana sono presenti i segnali mitogeni, che

possono attivare dei fattori trascrizionali, ma hanno anche una via

alternativa: la via di AKT.

L’attivazione mitogenica fosforila AKT a livello di vari residui (es. serina).

AKT, una volta fosforilato, va a inibire GSK3-beta. Quando è attivo (non

fosforilato), fosforila MDM2, che in questo stato non lega p53; quindi,

p53 non legato è libero di funzionare: abbiamo un blocco del ciclo

cellulare. Mentre, quando AKT blocca GSK3-beta, MDM2 rimane attivo

perché non è fosforilato, blocca p53 e non si ha il blocco del ciclo

cellulare. Quindi AKT limita l’azione di p53.

Recap: mitogeniàAKT fosforilatoànon fosforila GSK3-beta (attivandolo)àfosforila MDM2 (disattivandolo) → non

lega piu p53, che permane nella cellula e determina blocco del ciclo cellulare ed eventualmente apoptosi.

Ciò succede anche in una cellula trasformata: a livello dei check-point possiamo avere degli oncogeni/oncosoppressori

mutati che rendono la cellula indipendente da una segnalazione mitogenica, ma possiamo avere anche che una cellula

tumorale o una cellula iniziata riceve segnalazioni mitogene, che non permettono un completo funzionamento di p53

ecco perché tende a spingere in avanti nella fase di progressione neoplastica. Va a ridurre un po’ l’efficacia di un

à

meccanismo di controllo come quello di p53. Ciò può succedere anche in una cellula tumorale, dove l’impatto sarà

meno forte perché ci sono già altre de-regolazioni. Dipende da quanto è avanti il tumore tanto più è aggressivo,

à

tanto più è deregolato e quindi tanto meno avrà bisogno di mitogeni. Ci sono tumori, come l’eliomioma, che hanno 47

bisogno di estrogeni per essere sostenuti, per cui regrediscono nelle donne in menopausa perché la stimolazione

ormonale è un aspetto rilevante.

MUTAZIONI DI P53

Le mutazioni di p53, diversamente da Rb, presentano degli

hotspot nella sequenza di legame con il DNA (dominio di

binding al DNA) → le mutazioni cadono principalmente nel

dominio di legame al DNA.

Essendo p53 un fattore trascrizionale, legherà il DNA a

livello dei siti di riconoscimento di attivazione della

trascrizion