Appunti di Analisi e principi di biochimica della nutrizione umana

Tecnologie alimentari e principi di biochimica della nutrizione umana

pH-metro

Il pH-metro è un apparecchio elettronico usato per misurare il pH di un liquido. La sonda per il pH è generalmente un elettrodo a vetro che misura la differenza di potenziale elettronico su due lati di una sottile membrana di vetro posta all’estremità dell’elettrodo. Tale differenza di potenziale è legata alla differenza tra le concentrazioni degli ioni idrogeno all’interno e all’esterno della membrana. Tale segnale è proporzionale all’attività degli ioni H+ conformemente alla legge di Nernst. Un’unità di pH generalmente produce una differenza di potenziale di circa 0,059V. Questo strumento converte una differenza di potenziale in energia elettrica che poi viene misurata come quello che definiamo pH.

C'è un sistema con due elettrodi chiamati REF1 e REF2: uno è chiamato elettrodo di misura ed è a contatto con la soluzione da misurare detta soluzione test (REF 1). In realtà, l’elettrodo REF 1 non è proprio a contatto con la soluzione test. Viene immerso in una soluzione di riferimento perché altrimenti l’elettrodo stesso si sporcherebbe molto velocemente e non sarei più in grado di misurare nulla perché non passa più corrente.

Il diaframma è una membrana attraverso cui l’elettrodo comunica con la soluzione da misurare; quello che si sporca è il diaframma ed è infatti la parte che si usura prima. L’altro elettrodo viene invece inserito in una soluzione di riferimento a concentrazione costante di ioni H+, di solito è HCl 0,1M, e proprio la differenza di potenziale tra i due elettrodi mi permette di stabilire il pH della soluzione che sto misurando. Ovviamente, per poter misurare, il sistema deve essere chiuso, quindi deve esserci un ricircolo. Anche la soluzione di riferimento di HCl 0,1M deve interagire con la soluzione di riferimento, quindi in realtà ho due elettrodi immersi in due soluzioni di riferimento, tutte e due le soluzioni di riferimento sono a contatto con la soluzione da misurare ed è la differenza di potenziale tra i due che mi stabilisce il pH.

Ingrandimento di una membrana di vetro

Questa permette agli ioni di passare, è molto sottile (50 micron) e per poter far passare la corrente deve essere sempre idratata. Se si secca, non passano più gli ioni H+. Questo tipo di membrana di vetro è abbastanza selettiva per gli ioni H+ quindi li fa passare abbastanza bene, ma ci sono altri ioni che possono interferire. Uno di questi è lo ione sodio Na+. A volte capita che ci sia una soluzione con tanto sodio e, in quel caso, il pH-metro restituisce un risultato falsato perché sta misurando come ioni H+ anche gli ioni sodio. Un esempio eclatante è l’NaOH (idrossido di sodio), che è una base, quindi gli ioni H+ sono pochi e l’elettrodo dovrebbe leggere un pH altissimo, ma in una soluzione di soda avremo sempre una sottostima del reale pH, che risulta più basso di quello reale; viene chiamato errore alcalino. Questo può succedere, ad esempio, in una salamoia, non solo nel caso del NaOH.

All’interno dell’elettrodo ci sono due compartimenti:

• Un elettrodo di riferimento laterale (indicato come filo di argento) separato fisicamente dalla soluzione dell’altro elettrodo
• Nell’altro c’è il REF2 centrale immerso nella soluzione di HCl 0,1M

La parte in fondo è la membrana di vetro. Gli elettrodi, inoltre, quando non vengono usati, hanno un cappuccio con la soluzione di conservazione che serve a tenere la membrana idratata in modo che l’elettrodo sia sempre attivo. Nel momento in cui si immerge l’elettrodo, deve essere immersa sia la punta dove c’è la membrana di vetro sia il diaframma, perché altrimenti il circuito non si chiude. Devono essere entrambi a contatto con la soluzione.

Diaframma

La parte più importante dell’elettrodo. È di solito una superficie molto piccola, per non far entrare la soluzione che devo misurare con la soluzione che deve permettere il passaggio degli ioni, evitando contaminazioni.

Si possono utilizzare:

• Il diaframma smerigliato è quello più comune, è un foro coperto da un anello di politetrafluoroetilene che è un materiale che emette un elevato flusso di elettroliti e soprattutto si sporca poco.
• Oppure si possono utilizzare dei diaframmi di ceramica, la ceramica è un materiale poroso inerte che rispetto a quello precedente però fa passare meno l’elettrolita.
• Il diaframma aperto, non c’è un setto di ceramica o plastica che chiude il foro, l’elettrolita potrebbe fuoriuscire quindi si usa un elettrolita solido, che è un gel che contiene l’elettrolita e fa passare lo stesso la corrente elettrica ma, essendo gelificato, non fuoriesce e soprattutto non fa entrare la soluzione esterna.
• Ci sono delle situazioni in cui, se devo misurare il pH di una soluzione con pochissimi ioni H+, si usano degli elettrodi che invece di avere un diaframma che è solo un forellino sulla parete, è un anello di PTFE che circonda tutta la superficie dell’elettrodo, quindi ho una superficie di scambio molto maggiore e una sensibilità maggiore. Questi elettrodi vanno usati solo in determinate applicazioni, ad esempio sì per acqua ma no per latte.

La profondità di immersione

Una misura corretta del pH implica l’immersione dell’elettrodo fino a coprire il diaframma (altrimenti il circuito non si chiude).

Durata di un elettrodo

L’aspettativa di vita media di un elettrodo di pH è di circa un anno a seconda dell’impiego e della manutenzione che se ne fa, oltre a quanto la matrice sulla quale viene utilizzato è sporca. Gli elettrodi utilizzati ad elevate temperature hanno una durata inferiore. Anche gli ambienti altamente alcalini riducono la vita utile degli elettrodi.

Problemi frequenti

Una cosa comune può essere che il pH non è stabile e continua ad oscillare. L’impiego di un elettrodo inadeguato dà luogo a una serie di problemi che ne riducono drasticamente la vita utile:

• Ostruzione del diaframma: il diaframma si è sporcato e non fa passare bene gli elettroni, causando letture instabili. Ci sono delle soluzioni di lavaggio che si possono utilizzare oppure, quando si usano delle matrici proteiche, si usano delle soluzioni di proteasi.
• Contaminazione del sistema di riferimento: determina uno spostamento dei valori di pH; è possibile sostituirla spesso.
• Residui di sporco depositati sulla membrana: lentezza nella risposta e misure errate.
• Perdita di sensibilità o mancanza di linearità: causate da invecchiamento o erosione della membrana. La membrana spesso ha delle strutture laterali di plastica che proteggono la membrana di vetro da eventuali urti.

Tipi di elettrodi

• Quelli base/generali
• Per carni e formaggi si usano elettrodi a penetrazione che sono a punta, vengono piantati all’interno dell’alimento il quale deve avere un minimo di umidità per permettere il passaggio di corrente.
• Oppure un elettrodo che misura il pH delle superfici, sia la membrana che il diaframma sono sulla punta dell’elettrodo, quindi non serve immergere in una soluzione. Si usa molto nell’industria del pellame: si mette una goccia di acqua sulla superficie, si appoggia l’elettrodo, si strofina e abbiamo sia la membrana di vetro che il diaframma che sono sulla stessa superficie.
• Campioni che contengono solfuri, può capitare in alcuni vini, la presenza di zolfo può creare problemi perché la soluzione interna del diaframma è di solito in argento e il cloruro e l’argento possono reagire con lo zolfo e creare solfuro d’argento che è insolubile, quindi tenderebbe a formare una patina di sale insolubile che intasa completamente la membrana. Quindi lo zolfo per questo tipo di elettrodi non è indicato, si devono usare in questo caso degli elettrodi con delle soluzioni interne che non contengono argento.

Importanza del pH

Il pH è espresso su scala logaritmica, quindi da pH 3 a pH 4 la concentrazione di ioni H+ cambia di 10 volte. Il pH è importante per stabilire se stiamo lavorando bene a livello della produzione di alimenti, ma in un laboratorio anche per preparare le soluzioni che devono avere un pH ben preciso.

Spettrofotometro

Uno strumento che misura l’intensità luminosa, che può determinare l’intensità come funzione della lunghezza d’onda della radiazione luminosa. La spettrofotometria UV-VIS ha la caratteristica di essere usata per analisi quantitative perché la radiazione assorbita da un composto può essere correlata alla sua concentrazione.

La base dello spettrofotometro è la trasmittanza. La cuvetta contiene la soluzione da analizzare, questa viene colpita da un’intensità I₀ e se il mio campione contiene delle molecole in grado di assorbire quella luce, dall’altra parte ne arriverà solo una frazione perché una parte è stata assorbita. Trasmittanza = luce che è passata rispetto a quella che inizialmente ha colpito il campione. Più è bassa la trasmittanza, più il mio campione assorbe la luce. Siccome questa relazione è di tipo logaritmico, viene resa lineare dall’inverso della trasmittanza. Quindi si definisce assorbanza il logaritmo della trasmittanza, comunque una misura della capacità di un campione di assorbire la luce. A = ε x b x c

Legge di Lambert Beer

Una molecola assorbe la luce in funzione di 3 parametri:

• ε: è un fattore intrinseco della molecola, è una capacità della molecola ed è il coefficiente di estinzione molare; una molecola con una determinata struttura sarà in grado di assorbire una determinata lunghezza d’onda e una certa quantità. Ad esempio, gli antociani che sono composti colorati di rosso hanno un ε elevato nella zona del rosso. ε è un valore o tabulato o si calcola.
• b: cammino ottico, quanta strada percorre il raggio di luce. Se il raggio di luce attraversa 1 mm di soluzione, ho assorbanza pari a X; se invece aumento e la soluzione diventa 10 mm, l’assorbanza sarà 10X. Il cammino ottico lo si sceglie in base alla cuvetta che si mette nello spettrofotometro.
• c: concentrazione; se la molecola nella mia soluzione alla concentrazione 1M assorbe X, alla concentrazione 2M assorbirà 2X. Conoscendo ε e b, posso calcolarmi la concentrazione di una molecola, quindi riesco a trasformare un valore di assorbanza in un valore di concentrazione in mg/L. Questo è un aspetto quantitativo che mi permette di calcolare la concentrazione, ma l’assorbanza mi dà anche un aspetto qualitativo perché ε dipende dalla struttura della molecola. Ogni molecola ha uno specifico spettro di assorbimento che può essere utilizzato per la sua identificazione.

Se in una miscela è presente una molecola con un assorbimento specifico ed esclusivo, ad esempio i carotenoidi hanno un picco di assorbimento che è intorno ai 510 nm, allora si può fare quantificazione anche senza separazione. Giocando su ε, mi permette di misurare in maniera precisa una singola molecola all’interno di una miscela.

Esempio: separazione in HPLC di polifenoli estratti dal vino. Pongo uno spettrofotometro che legge soltanto le molecole che assorbono a 355 nm, che è il massimo di assorbimento dei flavonoidi, ma altre molecole hanno assorbimento a quella lunghezza d’onda. Quindi ciò che si fa è la lettura dello stesso campione invece che a 355 nm a 520 nm, che è il massimo di assorbimento di antociani, quindi riesco a identificare all’interno del vino i 5 principali antociani/glucosidi presenti nel vino. In base all’area di ciascun picco, io posso calcolare la concentrazione dei vari componenti.

Caratteristiche dello spettrofotometro

Lampada: è il dispositivo che emette radiazioni di intensità costante e stabile. Ormai tutti gli spettrofotometri hanno sia la lampada a deuterio che copre l’intervallo UV tra 180 e 370 nm, sia la lampada al tungsteno che copre tutto l’intervallo del visibile tra 330 e 2500 nm. Con tutte e due le lampade, lo spettrofotometro riesce a coprire tutto il range dall’UV a tutto il visibile. Di recente introduzione sono le lampade allo xeno, che coprono entrambe le zone e non necessitano di riscaldamento, oltre al fatto che invece di avere due lampade ne ho solo una.

Per poter sfruttare ε, dobbiamo selezionare la lunghezza d’onda. Per farlo uso un prisma che separa tutte le lunghezze d’onda. Ho le due lampade che generano un fascio di lunghezza d’onda che sono tutte insieme, colpiscono il prisma e questo le separa. All’interno della macchina c’è una rotellina che fa girare il prisma facendo in modo che alla finestra da cui esce il raggio che colpisce la cuvetta si allinei alla lunghezza d’onda che mi interessa.

Monocromatore: dispositivo che permette di separare il fascio di luce nelle diverse lunghezze d’onda che lo compongono.

Rivelatore: una volta passato attraverso il campione, dall’altra parte devo avere un detector che mi misuri quanta luce è arrivata. Si chiama fotomoltiplicatore, è un oggetto che genera corrente elettrica quando viene colpito dalla luce trasformando il segnale luminoso in segnale elettrico.

Considerazioni pratiche ed errori comuni

Di solito si parla di spettrofotometri a singolo raggio o a doppio raggio. Il singolo raggio è quello in cui c’è un fascio di luce che attraversa il campione e che io poi misuro. Nel doppio raggio, c’è un fascio di luce che esce dal prisma e che viene, attraverso uno specchio, diviso in due; metà va su una cuvetta di riferimento (che di solito contiene acqua), l’altra metà sulla cuvetta che contiene il mio campione. Lo strumento misura quanta luce viene assorbita dal riferimento, quindi mi toglie l’assorbanza dovuta al contenitore e all’acqua; questo valore che non sarà mai zero viene sottratto automaticamente dal valore di luce assorbita dal mio campione e ottengo il valore netto. Nel singolo raggio succede la stessa cosa, semplicemente non viene fatto in automatico ma manualmente. Esiste in questo caso la funzione “autozero” che permette di tarare lo strumento assegnando il valore “zero” alla cuvetta con il campione incognito, il risultato che si ottiene è già il valore “netto”.

Importanza del concetto del bianco o riferimento

Per ogni analisi è importante eseguire sempre un autocontrollo con un riferimento che contenga tutti gli stessi reagenti utilizzati per la determinazione, ma sostituendo il campione con un uguale volume di acqua. Quando si fa un’analisi, bisogna sempre avere il controllo negativo e il controllo positivo.

Utilizzo corretto delle cuvette

Le cuvette sono i contenitori in cui si deve posizionare il campione. La scelta della cuvetta è importante; una cuvetta di plastica e anche di vetro assorbe nell’UV. Le migliori in assoluto sono quelle in quarzo, sono trasparenti e simili al vetro e fanno passare sia il visibile che l’UV, ma sono costose e delicate.

È necessario valutare il tipo di analisi da eseguire:

• Lunghezza d’onda della misurazione: le cuvette sono fatte di materiale trasparente alla luce ma possono schermare la radiazione a determinate lunghezze d’onda. Il vetro normale già assorbe una gran parte della radiazione UV, per cui non può essere usato per le determinazioni che richiedono letture nell’ultravioletto (ad esempio 280 nm per la determinazione di polifenoli o proteine). In questi casi, si usano le cuvette di quarzo che sono trasparenti all’UV (o meglio, hanno una trasmittanza superiore all’80%).
• Esistono poi le cuvette:
  • Polistirene: trasparenti solo nel visibile
  • Polistirolo ottico
  • Polimetilmetacrilato (PMMA)
• Valutare anche i costi: le cuvette PMMA costano di più; evitare di utilizzarle per determinazioni nel visibile che potrebbero essere fatte con cuvette in polistirene. Le cuvette usa e getta sono, ovviamente, pezzi distinti che possono avere una leggera variabilità nella composizione (nelle migliori cuvette sia più o meno 1%); questo può comportare un errore nella determinazione (se uso ad esempio due cuvette diverse per il bianco e per il campione). Per determinazioni delicate, meglio comunque usare le cuvette di quarzo.
• Composizione della mix di reazione: la miscela di reazione potrebbe contenere solventi organici o acidi/basi forti che potrebbero intaccare la superficie delle cuvette, rendendole opache alla lunghezza d’onda d’interesse (ad esempio determinazione dei tannini con butanolo acido). In questi casi, valutare la compatibilità con il materiale plastico delle cuvette; nel dubbio, usare di vetro o quarzo.
• Volume delle cuvette: esistono delle cuvette con volumi da 3 ml fino a 5 µL. Ricordare che l’intensità del segnale è direttamente proporzionale al cammino ottico. La scelta del volume dipende dalla quantità del campione in esame (per quantificazione del DNA si usano microcapillari). Utilizzando delle cuvette più strette, diminuisce il cammino ottico; invece di usare una cuvetta da 10 mm, ne uso una da 5 mm e l’assorbanza sarà la metà. Posso comunque calcolare la...