Appunti corso Bioingegneria cellulare pt.2

Biongegneria cellulare

Microvilli

Abbiamo fasci paralleli, sono strutture che le cellule hanno negli epiteli per esempio. I villi si formano sfruttando strutture tissutali costituite da più cellule e i microvilli sono strutture che le cellule estroflettono sempre negli epiteli. Il motivo della creazione di villi e microvilli è aumentare la superficie attorno all'ambiente.

Il villo contiene un fascio parallelo, actina collegate tra loro tra molecole linker, che è la villina. La verde è la membrana cellulare e alla fine è cappato. Sono strutture per questo stabili. Si ha quindi un cappuccio proteico che blocca la + end dei filamenti di actina. Il collegamento nel caso dei villi con la membrana è mediato dalla presenza della miosina I come proteina motore. Nel microvillo ci sono circa 30 filamenti di actina. Si vedono i villi uno vicino all'altro e la membrana più scura e poi trasversali.

La struttura scura attorno alla membrana è un glicocalice, materiale saccaridico che le membrane espongono. Ci sono glicolipidi con polisaccaridi che creano protezione negli epiteli prima che abbiano contatto con la membrana. A sx si ha microscopia elettronica a scansione, a dx trasmissione, si hanno singoli filamenti di actina. Il fascio è in una parte del corpo cellulare, terminal web (con filamenti intermedi).

Miosina I e II

• Miosina I: Miosina monomerica che interagisce con il citoscheletro di actina ed è deputata al trasporto di vescicole. Svolge ruolo di chinesine e dineine in una cellula in quiete. La troviamo addensata nelle regioni popolate da filamenti di actina (tutta la regione corticale, movimento di vescicole, vicino alla membrana) perché si attacca solo all'actina. Trasporta da un punto all'altro le varie vescicole;
• Miosina II: Dimerica, si trova nei fasci contrattili, fibre da stress. Hanno molecole linker lunghe (alfa-actinina) che consente ingresso molecole grandi come la miosina II. Miosina II entra nei fasci e genera anche all'interno del citoscheletro di una cellula normale (non solo nei sarcomeri) degli sliding e quindi accorciamenti di determinate strutture. Quella nella foto a sinistra è la miosina II e anche nell'immagine a forza atomica.

Entrambe le miosine hanno attività ATPasica, le miosine hanno una tasca per ATP, collocata nella zona delle teste. Il sito specifico per l'ATP è quindi nella zona globulare, a sx si vede un diagramma che ci fa vedere la struttura primaria. In alcuni schemi più dettagliati vediamo anche il numero amminoacidi in alcuni punti. Spesso diagrammi di questo tipo hanno evidenziati alcuni domini specifici di cui si conosce la funzione. Le due bande nere identificano la regione nella sequenza primaria che contiene ATP binding site vicino all'N terminale che si ha nella regione globulare molecola. Altro elemento che abbiamo è il sito di legame con l'actina, sempre contenuto nella regione delle teste.

Le miosine sono attivate dal calcio, l'ATP viene idrolizzato e le molecole svolgono cambiamenti conformazionali (motori lineari) e quindi camminano in una direzione camminano verso la + end e sono mono-direzionate. Entità del passo/movimento = 5-10 nm, sincronizzati con il ciclo dell'ATP. Per ogni ATP consumato la miosina avanza. Sia per miosina I che II, e la miosina I si porta anche il cargo.

Esempi delle miosine

• Miosina I che sta portando filamenti di actina essendo legata ad un altro filamento di actina. Pezzetti di citoscheletro di actina già formato possono essere veicolati dalla presenza di miosine I. La miosina I non solo è in grado di legare le vescicole (cargo), lega anche altre fibre di actina, actine stabilizzate e non disposte in rete. Si ha trasferimento di actina che è spezzettata e vengono trasportati dove si vuole rifare polimerizzazione essendo stabili;
• Miosina I che trasporta vescicole di membrana;
• Miosina II che svolge funzione contrattile, le miosine II formano delle strutture le cui teste lavorano muovendosi sempre verso la + end e fanno in modo di operare uno sliding che avvicina le – end fino a sovrapporle. I due filamenti scivolano l'uno sull'altro e se sono ancorati da qualche parte viene operato meccanismo di accorciamento/contrazione del fascio di filamenti che si è attivato. Se collega dei filamenti del network corticale, vuol dire che sta apportando dei cambiamenti/spostamenti di corpuscoli all'interno della cellula che possono essere mossi attraverso il citoscheletro;
• Miosina I come trasportatore di filamenti di actina ma non legandosi ad un altro filamento di actina, ma legandosi direttamente in membrana. Fanno scorrere sulla membrana dei filamenti, sempre per trasportarli nella regione di interesse (deforma il network corticale).

La miosina II

È nel sarcomero contrazione muscolare. È una struttura a base di filamenti di actina e miosina. I filamenti di actina sono quelli che si formano nel citoscheletro, ma nel sarcomero i filamenti di actina hanno lunghezza standard perché vengono cappati da Z-cap e tropomodulina. Questo consente alla struttura del muscolo di impaccare fasci di actina con una lunghezza ben determinata e i filamenti di actina (rossi) che sono cappati. Lo Z-disc è una regione in un cui abbiamo le Z-cap, in cui ci sono tutte le molecole di capping, dall'altra parte è raggruppata la tromodulina.

Ai filamenti di actina si intercalano i filamenti di miosina, i più spessi. La miosina II si aggrega per mettere in comune i loro steli a formare dei filamenti con lunghezza predefinita. Le teste della miosina fuoriescono da questi filamenti con ripetizione regolare e il fatto che le teste della miosina legano le fibre di actina, consente il movimento delle teste di miosine verso la + end (dal lato dello Z-cap) e questo comporta spostamento dei due dischi verso il centro.

Nei muscoli, il citoscheletro di actina è sempre in grado di formare fibre da stress e strutture che coinvolgono fasci di actina e miosina II. Nelle altre cellule, dove trovo le fibre contrattili?

• Nella fase finale della divisione cellulare, quando le due metà cellule si separano, nella fase di citochinesi, in cui si forma una strizione ad anello. Nella regione centrale parte una polimerizzazione atta a costruire dei fasci di actina contrattili che progressivamente riducono l’anello. I fasci di actina si formano, interagiscono con la miosina II (fascio antiparallelo) e questa contrazione riduce la circonferenza progressivamente, fino ad arrivare ad una riduzione lume pervio così bassa che si ha una fusione di membrane;
• Regione delle tight junction per cellule epiteliali endoteliali, cellule che aderiscono tra loro a formare monolayer, cellule che poi si polarizzano. Endoteli ed epiteli hanno tight in cui la cellula si fonde con quella affianco. Sono delle regioni sollecitate e a rischio di strappi, quindi sono regioni molto rinforzate.

Anche in questa regione si forma la adesion belt, cintura di adesione, e a livello di essa si ha la formazione di fibre da stress, contrattili, che consentono di regolare, avvicinare e rafforzare, resistere alle tensioni, la regione della tight junction;

• Fibre da stress: Fibre che la cellula genera quando aderisce ad un substrato piano. Cellule in coltura, come i fibroblasti, si attaccano alla superficie e assumono una forma molto estesa. In questa situazione la cellula si aggancia tramite punti di contatto e rimane schiacciata. Assumendo questa posizione sviluppa lungo la sua lunghezza, per mettere in collegamento la parte posteriore con anteriore e resistere a tensioni di estensione in entrambe le direzioni, sviluppa le fibre da stress.

Funzioni dei filamenti di actina

• Resistenza meccanica: Costituire la regione della corteccia, è il naturale rinforzo della membrana citoplasmatica. La membrana si comporta come liquido e non solido, che ha una resistenza a compressione, trazione e flessione molto bassa. Con essa resiste agli stimoli esterni è difficile da credere e per questo sotto alla membrana c’è tutto il citoscheletro corticale, come elemento di rinforzo che da resistenza meccanica a tutta la superficie cellulare;
• Adesione: la capacità del citoscheletro di actina di legare proteine transmembrana a proteine del citoplasma. Creare un collegamento interno-esterno creando tutti i punti di ancoraggio;
• Capacità del citoscheletro di actina di guidare tutti i cambiamenti di forma a livello della membrana cellulare: Che sia puntale, planare o globale è guidato da cambiamenti regolati dal citoscheletro di actina sotto la membrana. I cambiamenti di forma includono anche migrazione e locomozione. La membrana quando cambia forma può fare:
  • Protrusioni sottili (filopodi);
  • Estensioni a foglietto (lamellipodi);
  • Invaginazioni della superficie cellulare: anche tutti i meccanismi di creazione vescicole verso esterno o inglobamento verso l’interno sono tutti meccanismi mediati dall’actina.

Funzione di adesione

Sia l’adesione cellulare che la locomozione sono funzioni controllate da reti o fasci di filamenti di actina. In questi meccanismi c’è sempre anche connessione con le integrine. Nell’adesione si ha collegamento tra fasci di actina e integrine di membrane che collegano con il resto del mondo. Questo è un meccanismo naturale della cellula viene a volte sfruttato per incentivare adesione cellulare su substrati diversi da quelli naturali. Studiando i meccanismi di connessione e interazione si può agire nella stessa direzione chiamata mimesi, cercando di mimare quello che succede in natura anche con materiali non naturali.

Le integrine hanno una sequenza, che serve per replicare su materiali non adesivi per cellule, riprodurre sequenza RGB (3 aa che la costituiscono) che si ripetono e sono elemento di collegamento tra integrine e matrice ECM questa sequenza favorisce l’adesione perché la riconoscono come una sequenza presente su integrina. Così la cellula si collega al suo substrato nel tessuto in cui è immersa e si integra con il resto del mondo.

Contatti focali

Questa connessione avviene proprio con i contatti focali. L’adesione ad un substrato è mediata da cambiamenti di forma indotti da actina e dal consolidamento di alcune regioni in cui avviene contatto dentro-fuori = contatti focali. Essi sono i punti in cui la cellula aderisce in modo stabile ai suoi substrati. Non è una zona molto estesa ma coinvolge piccole regioni in cui si formano fasci di actina antiparalleli legati da alfa actinina in cui ha miosina che consente di deformare la membrana, e queste strutture che si formano danno una situazione in cui la cellula si deforma ed espone un piede con cluster di actina che si stabilizza creando collegamenti con il substrato mediante le integrine.

Immagine A e B sono due immagini differenti della stessa cellula. In A vediamo rappresentazione in cui sono evidenziati i contatti focali, le macchie nere sono le regioni in cui si è formato il contatto focale. In B vediamo marcati i filamenti di actina e vedo come si distribuiscono nella cellula adesa.

Il contatto focale, schema, che è una sezione trasversale, sotto ho la ECM, membrana citoplasmatica e sopra ho il citosol cellulare, con integrine, proteine transmembrana con RGB che si legano alla membrana da pare del citosol. La parte intracellulare vede un cluster di actine, un fascio antiparallelo collegato con le alfa-actinine (verde) che legano i fasci di actina cappati. Ciascun filamento del cluster è collegato all’integrina in modo indiretto, ma il contatto è mediato da specifiche proteine la proteina che lega l’integrina è la talina, essa lega da un lato l’integrina e dall’altro collega l’actina + un ulteriore complesso proteico che è la vinculina.

La vinculina è una proteina specifica del contatto focale, si ha solo qui. Ci sono una serie di linker nel contatto focale, importanti sono la vinculina e la talina. Più usate anche per fare marcature (vinculina soprattutto). Il contato focale è quindi un collegamento indiretto tra actina e integrina, mediato da vinculina e talina, con anche alfaactinina. Nelle immagini qui si hanno due cellule in cui è stato fatto uno staining su cellula adesa, in verde actina e in rosso vinculina. i fasci ben definiti sono le fibre da stress e in rosso sono le regioni in cui si hanno i contatti focali.

Esempio di attivazione piastrinica

Cosa succede quando una piastrina si attiva?

• Una piastrina in quiete ha un citoscheletro formato, molti dei filamenti di actina sono formati lunghi e stabili + monomeri liberi in soluzione. Se la piastrina è in quiete, i filamenti di actina sono cappati e ciò caratterizza una piastrina non attivata;
• Il segnale di attivazione è mediato dal calcio, flusso elevato di calcio nella cellula e l’innalzamento della concentrazione del calcio attiva tutte le gelsoline in giro. Esse iniziano a legarsi lateralmente sui filamenti di actina, uno dei domini si incunea, approfitta dei moti browniani e chiude con gli altri domini, taglio e cutting. Da citoscheletro intero a tagliato, con tanti piccoli filamenti tagliati e cappati alla + end;
• Ottengo un citoscheletro frammentato;
• Arriva un segnale che blocca attivazione gelsoline e i capping grazie ad inibitore. La situazione che ottengo è con tanta presenza di filamenti corti e monomeri liberi in soluzione. Si va in stallo e se non ci sono altre inibizioni, parte una polimerizzazione, perché i frammenti sono perfetti nuclei. Questo è il momento in cui piastrina fa lo spreading crescita su tutti i lati + formazione di citoscheletro con filamenti lunghi a partire da frammentini liberati da gelsolina;
• Esauriti tutti i monomeri liberi a disposizione, la piastrina si contrae, si sono formate diverse strutture (tra cui i fasci contrattili) e poi ad un certo punto si assiste a un’ulteriore contrazione. Quindi, dopo lo spreading ho riadeguamento della forma del citosol ma da qualche parte queste strutture rimangono bloccate dai filamenti da stress. È la situazione finale. Spreading e poi contrazione è il movimento che la piastrina fa nella formazione di un coagulo.

Funzione di locomozione

Quando una cellula è attratta in una certa direzione da uno stimolo di qualsiasi natura e parte un segnale che è quello della migrazione, si innescano una serie di cambiamenti a livello del citoscheletro. Il filamento principale che determina le modifiche a livello del meccanismo di migrazione e locomozione è l’actina. Schema con passi successivi della cellula in movimento verso substrato e cellula adesa. La cellula ha dei contatti focali. Quando parte un stimolo di migrazione e locomozione, in modo preferenziale, in una direzione ben precisa, quella da cui viene lo stimolo, la cellula inizia ad allungarsi e quindi ad estroflettere la propria membrana. Se la cellula non ha nessuna direzione preferenziale, nel momento in cui c’è un segnale che l’attira e si vuole muovere in quella direzione ho cambiamenti di forma che la spingono ad estendere la propria membrana in quella direzione.

Inizia a formare la struttura del lamellopodio = estensione planare in una direzione precisa. Il lamellipodio si forma grazie alla polimerizzazione di actina. Cosa consente di estendere la membrana? Sono delle modifiche a livello del citoscheletro di actina, strutture di actina che stanno crescendo. La struttura più ovvia che cresce è il fascio parallelo di actina che ce l’ho sia nel filopodio che nel lamellipodio.

Mi devo immaginare una struttura a pettine nel lamellipodio, che va in una soluzione per far sì che i fasci lavorino è avere a disposizione monomeri, per avanzare devono costruire, plus end di fasci paralleli con monomeri liberi che crescono liberi, non cappati con disponibilità di monomeri sul fronte di avanzamento. L’estensione della membrana è coadiuvata anche dai MT che hanno resistenza a flessione maggiore, in queste regioni, per mantenere il terreno guadagnato, intervengono anche MT che coadiuvano la crescita e mantengono la membrana in posizioni più resistenti.

Se la lamella si estende, ad un certo punto si dovranno creare sotto al lamellopodio nuovi contatti focali. Il citoscheletro interno è in contatto con la membrana come avevamo detto tramite le integrine. Inizia la fase di retraction, estensione del citoscheletro La parte posteriore è in tensione e quindi i contatti focali dietro vengono messi in crisi fino a staccarsi. All’interno della cellula si formano fibre da stress che consentono di portare avanti tutto il citosol in massa.

Altro problema relativo alla regione retrostante, in questa regione ci immaginiamo che deve portare dietro una parte grossa, se dietro avessi solo ctisol da portare avanti avrei una situazione più agevole, quindi nella parte posteriore il citoscheletro si sta distruggendo attivazione meccanismo stimolato dal calcio, attivazione di tante gelsoline che fanno come nella piastrina, cioè frammentano l’actina in piccoli pezzi = passaggio del citoscheletro da stato gel (reticolato) a stato (sol)uzione, come se fosse un citosol fluido. Nella regione retrostante ho quindi bisogno di alte composizioni di calcio, la gelsolina che si attiva e per mettere in tensione la parte retrostante servono fibre da stress, quindi miosina II per metterla in tensione. Davanti ho miosina I, non molto calcio perché se no attivo le gelsoline e ho un meccanismo di trasporto del materiale di costruzione molto ben attivo in continuazione grazie alle miosine I tutto questo sistema si autoso