Appunti completi Bioingegneria cellulare

Aspetti evolutivi dell’origine della vita

Le stelle sono caratterizzate da atomi leggeri (H, He, etc.) che nulla hanno a che fare con gli atomi che compongono gli esseri viventi. Gli elementi più pesanti (C, N, e P) delle stelle vengono sintetizzati negli stadi finali della vita stellare e sono stati disseminati nello spazio durante l’esplosione delle Supernove. Per avere degli atomi pesanti dobbiamo aspettare quindi un ciclo stellare (diversi miliardi di anni).

Datazione dell'universo e della Terra

• Età universo: 13.5 e 14 miliardi di anni.
• Età Terra: 4.5 miliardi di anni (ma per circa 0.5 miliardi è stata inabitabile).

Le prime evidenze di forme di vita vengono datate intono ai 3.5 miliardi; questo lascia aperta quindi una finestra di circa 500 milioni di anni (probabilmente 200-300) per l’apparizione e lo sviluppo della vita sulla Terra. Gli spettri relativi all’emissione dei corpi celesti rilevano che lo spazio è costellato da nuvole (polvere interstellare) dense di particelle microscopiche (complessi contenenti C, H, O, N e talvolta anche zolfo e silicio). Questi complessi si trovano sotto forma di radicali liberi estremamente reattivi o piccole molecole. L’analisi dei corpi celesti è stata possibile con lo studio del meteorite caduto nel 1969 in Australia e con la cometa Halley.

Esperimenti del 1950

Sono stati realizzati intorno al 1950 per studiare come la radiazione luminosa, riprodotta da scariche elettriche, potesse aver influenzato l’atmosfera terrestre primordiale e risultò che circa il 15% degli atomi di C costituenti metano, sottoposti a scariche elettriche, si erano organizzati in diversi tipi di amminoacidi e in altri composti biologici chimicamente rilevanti; questi composti sono il risultato di semplici reazioni chimiche (nasce la chimica dei composti del C). Quindi se andiamo a irraggiare l’atmosfera otteniamo degli amminoacidi ma se guardiamo gli organismi viventi sono fatti da più tipologie di molecole biologiche.

I costituenti degli organismi viventi

Le classi principali di molecole base sono: acidi nucleici, proteine, carboidrati e lipidi. Date queste 4 categorie di molecole base quale può essere nato per primo? Carboidrati e lipidi no perché hanno bisogno di macchine molecolari per essere prodotti (non sono semplici e non si possono autoassemblare). Le proteine invece possono auto assemblarsi perché sono catene di AAs. I lipidi inoltre hanno funzione protettiva, quindi, devono avere qualcosa da proteggere! Ci si è sbilanciato sugli acidi nucleici perché collegato all’RNA come prima catena capace di autoprodursi e autosostenersi (si indica il primo periodo evoluzionistico con il termine di RNA world). Avere solo la molecola di RNA non è però sufficiente per garantire lo sviluppo ma RNA world poté svilupparsi solo a partire da un sistema di reazioni chimiche che ne fornirono il substrato e che lo sostennero con un insieme di processi (protometabolismo).

Molte ipotesi furono avanzate in merito alle caratteristiche di questa fase di sviluppo una di queste si basa sui legami tra atomi di zolfo e atomi di carbonio dei composti acilici che insieme formano composti che prendono il nome di tioesteri (R-SH+R’-COOH→R-S-CO-R’+H₂O con R-SH tiolo e R-S-CO-R’ tioestere). I tioesteri sono strutture altamente energetiche (molto simile a ATP). Gli acidi carbossilici sono stati trovati sui composti dei corpi stellari mentre i tioli provengono dalle eruzioni vulcaniche.

Perché RNA? Perché l’RNA può creare un’altra molecola di RNA, anche il DNA può ma non da solo (ha bisogno dell’RNA) e le proteine non possono. L’RNA contiene la codifica per sé stesso quindi si autosostiene. Le proteine non hanno la codifica e hanno bisogno di qualcosa che codifica per loro. Il RNA ha inoltre delle capacità di catalisi quindi regolazione di una serie di processi.

Sviluppo dell'RNA world

All’inizio si sono formati i tioesteri che hanno fornito il substrato che ha prodotto i nucleotidi; poi si è formato il RNA e questo si è replicato ma ad ogni replica può introdurre degli errori. Sulla base di queste mutazioni vengono fatte delle selezioni e questo ha portato alla formazione di proteine per mezzo dell’RNA (mettere insieme AAs e costruire proteine). Tuttora le proteine vengono prodotte nel ribosoma in cui è presente molto RNA quindi l’RNA rimane molto presente nella sintesi delle proteine. Alcune delle proteine prodotte fanno da supporto all’RNA nella sua replicazione (feedback positivo tra RNA e proteine). Le molecole di RNA che producono proteine hanno quindi un vantaggio evolutivo.

Nasce l’esigenza di avere una molecola specifica che favorisca il trasporto degli AAs (specializzazione della molecola RNA transfer) e vengono prodotte anche proteine catalitiche. Il DNA è stato l’ultimo a fare la sua comparsa dopo che è nata l’esigenza di complessità. A lui è deputato il compito di contenere e proteggere le varie informazioni.

Organizzazione degli esseri viventi

Ogni essere umano nel suo sviluppo individuale (ontogenesi), a partire dall’embrione, percorre una vicenda simile a quella dell’evoluzione delle specie viventi sul pianeta (filogenesi), a partire dal primo essere monocellulare sino alla realizzazione più specializzata che è l’uomo. Il patrimonio genetico dell’uomo contiene buona parte delle informazioni relative alle specie precedenti ed è il risultato dell’inibizione di caratteristiche precedenti e dell’integrazione di ulteriori specializzazioni. Ontogenesi fornisce una chiave di lettura anche per andare a capire qual è il processo di costruzione degli organismi e degli spunti su come analizzarli.

Esempi: elementi di base → biomolecole → sub strutture → cellule ecc. Capire come la struttura biochimica è l’elemento chiave per capire le funzioni (Struttura → funzione).

Gli elementi chimici dei sistemi viventi

Nell’uomo si trovano 41 specie chimiche le cellule e i tessuti dell’uomo sono costituiti da:

• C, H, O, N, P, S più del 99% del peso totale (87% sono H e O)
• Na, Ca, Mg, K, Cl 1% combinate in molecole o ioni
• Tracce di altri dodici elementi: Cu, F, Fe, I, etc. (oligoelementi presenti sotto forma di ioni organici)

Si può stimare che le specie viventi sulla Terra siano intorno ai 10 milioni. Tutte però sono caratterizzate da similitudini negli elementi chimici (visti prima), grande somiglianza nei meccanismi molecolari alla base delle funzioni vitali ed una grande diversità architetturale (da monocellulari ad organismi complessi). Questa grande diversità si è evoluta anche grazie alle interazioni con l’ambiente. Ciascun organismo trasmette le caratteristiche della specie ai figli. Anche se le forme finali sono molto diverse le codifiche invece sono rimaste invariate e quindi nel nostro patrimonio genetico ci sono una serie di caratteri e caratteristiche che si sono conservate nel tempo. La trasmissione è possibile grazie al DNA.

Introduzione alla cellula

Le cellule batteriche sono principalmente composte da acqua (70%) ma la componente chimica è composta principalmente da RNA e proteine. In generale gli organismi viventi utilizzano l’energia libera per poter mantenere la loro organizzazione molecolare e strutturale. L’energia libera è ciò che consente alla cellula di svolgere le reazioni chimiche. Ogni meccanismo alla base ha delle variazioni di energia libera (ΔG) e dalla parte della cellula c’è una spesa di energia libera. Gli organismi in questa attività si basano da una serie di complesse reazioni chimiche. Sia l’architettura che il complesso delle reazioni chimiche vengono trasmesse nel codice genetico.

DNA struttura e dimensioni

Il DNA è una struttura a doppia elica composta da due filamenti (double strand) ciascuno costituito da 4 tipi di nucleotidi. Ogni nucleotide è costituito da un gruppo fosfato collegato ad uno zucchero, a sua volta collegato ad una base. Il fosfato di zucchero è uguale in tutti i nucleotidi, quello che cambia è la base (adenina, timina, guanina e citosina). L’avvolgimento del DNA è tale per cui ad ogni giro si hanno allocati 10 nucleotidi (dopo 10 ho fatto un intero avvolgimento). Il passo è di 3.4 nm (34 Amstrong). In una cellula troviamo 1.6x10⁹ coppie di basi. Le basi nell’accoppiamento tra i due strand non si possono accoppiare in modo qualunque ma ci sono le coppie fissate. Questo perché le coppie sono simili tra loro: C e G fanno tre legami mentre A e T ne fanno due. Il DNA, quindi, è una struttura molto lunga (2 m totale in una cellula) ma con diametro molto piccolo (2 nm).

Nell’elica i gruppi fosfato vanno verso l’esterno, le basi sono verso l’interno. Le basi possono avere 2 o 3 atomi elettronegativi che danno origine alla formazione di legami H (N e O sono elettronegativi). La struttura del DNA ha legami covalenti (forti) all’interno del singolo filamento mentre le interazioni tra le due catene sono governati da legami deboli (legami H con energia di dissociazione molto inferiore rispetto ai legami covalenti). Il numero totale dei legami H è comunque elevato quindi la struttura risulta stabile. L’apertura, infatti, non avviene in modo naturale. Questo è un esempio di come legami deboli ripetuti in tutta la lunghezza portano comunque ad una stabilità forte.

Replicazione e trascrizione del DNA

Duplicazione del DNA= divisione cellulare e copia completa. Trascrizione del DNA= riguarda solo la trascrizione di porzioni di interesse per la sintesi di una specifica proteina (quindi il DNA viene aperto ma non tutto). Quindi quello che differenzia duplicazione e trascrizione è il risultato (copia di DNA o copia di RNA).

1. Replicazione: DNA replica il suo contenuto informativo mediante un processo che coinvolge diversi enzimi.
2. Trascrizione: DNA codifica la produzione del RNA messaggero (mRNA) quindi si passa da DNA ad RNA. In realtà nel nucleo viene prodotto quello che è detto RNA nucleare che attraverso lo splicing da origine al mRNA che esce dal nucleo ed entra nel citoplasma.
3. Processazione: nelle cellule eucariote, mRNA viene processato e migra dal nucleo al citoplasma cellulare.
4. Traduzione: mRNA porta il codice di informazione al ribosoma, che lo legge e lo utilizza per la sintesi delle proteine; si passa dal linguaggio dei nucleotidi a quello degli amminoacidi.

Nel momento della replicazione la topoisomerasi percorre e srotola la doppia elica e i legami H vengono rotti per far sì che le due catene lineari si separino. Questo è possibile grazie ad alcune molecole tra cui la principale è l’elicasi (grossa proteina che va ad incunearsi tra le eliche, distanziando per una parte della lunghezza i due filamenti e va a rompere i legami H in quella regione). Intervengono anche delle proteine di binding che prevengono il fatto che la doppia elica vada a richiudersi subito dopo l’elicasi perché vanno a irrigidire la struttura del DNA che rimane bloccata.

A questo punto in base all’obiettivo intervengono le DNA polimerasi (nel caso della duplicazione) o la RNA polimerasi (nel caso della trascrizione). Le polimerasi sono degli enzimi che sono in grado di processare il filamento di DNA andando a leggere e trascrivere quindi leggono il nucleotide e legano il nucleotide corrispondente alla sequenza che c’è in corso. Non sono bidirezionali ovvero non possono muoversi in entrambe le direzioni (motore molecolare processivo direzionato). Quindi le polimerasi sono in grado di leggere il filamento che fa loro da stampo (template) e lo percorrono dal 3’ al 5’. Per cui producono un filamento al contrario (dal 5’ al 3’). Il filamento che segue la direzione della polimerasi è detto filamento veloce (o guida). L’altro invece è il filamento lento in cui la polimerasi va nel verso opposto rispetto all’elicasi quindi procede finché non trova il filamento chiuso. Su questo filamento la replicazione avviene a frammenti, infatti, a completare il lavoro, c’è un secondo meccanismo composto dalla DNA primasi che sta ferma e si attacca nei punti in cui è necessaria e produce l’RNA primer (singoli nucleotidi collegati ad un nucleotide della sequenza) ovvero punti di innesco per le polimerasi che producono piccoli frammenti di DNA (frammenti di Okasaki). Con la endonucleasi vengono rimossi gli inneschi di primer (perché è un RNA) percorrendo lo stand e lascia un buco; a questo punto devono intervenire altre polimerasi che vanno a completare i buchi lasciati dai primer (va ad apporre delle T al posto delle U) ed infine la DNA ligasi che consente di attaccare tra di loro i frammentini.

Duplicazione → DNA polimerasi. Trascrizione → RNA polimerasi, ho solo un tratto che devo trascrivere in RNA per codificare una proteina. Durante la trascrizione viene sintetizzato un filamento di mRNA dal 5’ al 3’ che è quello che codifica per la proteina. Quindi dei due filamenti:

• Filamento senso cioè che ha la stessa sequenza del mRNA e codifica la proteina.
• Filamento antisenso è lo stampo per la trascrizione del mRNA. RNA antisenso non è codificante. Negli eucarioti serve per regolazione dell’espressione genica mentre nei plasmidi e nei virus (in cui c’è poco spazio) per codificare il materiale genetico i geni sono sovrapposti quindi in una direzione per la proteina e in un’altra per un’altra. In questo caso anche l’antisenso codifica ma è dovuto alla necessità di contenere la maggior parte di info possibili in un genoma ridotto.

Questi momenti di apertura e chiusura sono a rischio di errori per cui tutto questo processo comporta un certo rischio di introdurre errori durante le operazioni. L’organismo deve garantire con la maggior probabilità possibile di trasmettere tutta l’info possibile.

Impaccamento del DNA

Il cromosoma è il massimo addensamento del DNA. Ciascun cromosoma ha la sua peculiarità e si può capire dalla morfologia quali geni sono contenuti. Non sono strutture lisce ma scaffolds molto addensati formati da cromatina (filamento) formati a sua volta da proteine e DNA organizzate in modo da ridurre lo spazio. Il volume del nucleo è il 10% del volume cellulare.

I cromosomi sono formati solo in un momento specifico della vita cellulare ovvero la fase di mitosi cellulare (in particolare la metafase). In tutte le altre fasi (interfase, sintesi di proteine) nel nucleo si vede una struttura meno condensata detta cromatina (side struttura). È possibile osservare la cromatina denaturando una cellula, rompendo la membrana cellulare (con tamponi a bassa forza ionica come detergenti), in modo da causare la lisi del nucleo; a questo punto, a microscopio, è possibile osservare una struttura detta filo di perle ovvero una sequenza di catenelle (palline = nucleosoma, filo = DNA linker ovvero porzione di DNA libero). Questa struttura fisiologicamente nella cellula non c’è mai ed è un artefatto di tecnica (perché non c’è H1).

Le dimensioni del cromosoma sono nell’intorno 1/1.5 micron di larghezza e 2/3 micron di lunghezza. Se vado a guardare uno dei telomeri è possibile distinguere uno scaffold condensato con delle anse molto strette composto da uno scaffold esteso con un ordine di decimi di micron. A formare questo scaffold esteso è un filo più sottile che è la cromatina ovvero un avvolgimento di nucleosoma + DNA linker quindi una sequenza di nucleosomi a filo di perle. Questa sequenza ha uno spessore di 10 nm. Il DNA linker è di 2 nm.

NB. Scaffold condensato e scaffold esteso si distinguono per il diverso livello di addensamento della struttura e per il fatto che si formano in due momenti diversi della vita cellulare (esteso durante l’interfase ovvero la normale vita della cellula e quello condensato solo durante la formazione dei cromosomi).

Il nucleosoma

È composto da un core di 8 proteine uguali a 2 a 2 dette istoni intorno al quale si avvolge il DNA (facendo poco meno di 2 giri). Il DNA viene infine chiuso da una proteina sempre istonica (H1) che regola la chiusura del DNA libero (tipo graffetta). La dimensione totale del nucleosoma è di 6x11/12 nm. L’ottamero di proteine ha una struttura praticamente circolare che funge da rocchetto per il DNA. Per ogni nucleosoma ho impaccato 200 basi. L’ottamero è costituito da 4 diversi istoni (H2A, H2B, H3, H4). Quindi durante la lisi dei nuclei è scomparso il H1 e il DNA linker si è disfatto. L’H1 regola la posizione relativa dei nucleosomi perché ingombra → struttura a solenoide.

NB. I modelli molecolari si ottengono in due modi:

• Cristallografia: purificare la proteina e metterla in condizioni tali da formare un cristallo. Una volta che si ha il cristallo si sottopone la proteina a una cristallografia e si va a vedere all’interno del cristallo come vengono cambiati i raggi. Ottengo in che punto dello spazio ho un atomo e di che tipo è e si ricostruisce la mappa.
• NMR: la proteina è mantenuta in soluzione e si va ad analizzare statisticamente estraendo la conformazione a struttura più probabile. Vantaggio di avere una conformazione 3D più vicina.

Ruolo dell'istone H1

H1 si lega con il DNA linker, tuttavia il suo ruolo preciso non è ancora del tutto chiarito ma sicuramente è coinvolto nel primo livello di organizzazione (regola l’impaccamento dei nucleosomi); il controllo dell’istone H1 avviene attraverso una fosforilazione: si aggiunge un gruppo fosfato con carica negativa che riduce l’interazione con il DNA (perché anche il DNA su ogni strand ha una carica negativa per ogni base). La fosforilazione cambia anche la conformazione della proteina che cambia l’affinità per il nucleosoma. Il nucleosoma, quindi, lascia libera la cromatina che inizia a srotolarsi.