Appunti Chimica analitica

Cromatografia su colonna

Una miscela di analiti viene separata mediante il passaggio attraverso una colonna nella quale vengono selettivamente ritenuti. La colonna è riempita con una fase stazionaria, e la si fa attraversare dall'eluente (che scende per gravità). La cromatografia può essere di adsorbimento (interazione col supporto solido), o di ripartizione (tra eluente e un liquido adsorbito sul solido).

Nelle strumentazioni moderne (HPLC) è possibile rilevare opportunamente gli analiti che fuoriescono dalla colonna, e ottenere la visualizzazione di un segnale per ogni analita. Ogni analita che esce dalla colonna genera un segnale che viene registrato sotto forma di un "picco cromatografico". La successione dei vari picchi prende il nome di cromatogramma. L'area di ogni picco è proporzionale alla concentrazione della sostanza in esame.

4. Cromatografia a fase normale

In un sistema cromatografico...

A fase normale la fase stazionaria è più polare della fase mobile. Gli analiti idrofilici avranno alta affinità con la fase stazionaria e saranno quindi ritenuti all'interno della colonna. Per l'eluzione si impiegherà una fase mobile inizialmente apolare e poi man mano sempre più polare.

Fase mobile: se rimane costante durante tutta l'analisi eluizione isocratica, se cambia composizione durante l'analisi gradiente di eluzione.

Cromatografia a fase inversa

In un sistema cromatografico a fase inversa la fase stazionaria è meno polare della fase mobile. La fase stazionaria è costituita da un supporto di silice a cui è legata una specie organica chimicamente legata, ad esempio catene alchiliche a 8 o 18 atomi di C (C8 o C18). Gli analiti idrofobici avranno alta affinità con tali sistemi e saranno quindi ritenuti in colonna. Per l'eluizione si impiegherà una fase mobile inizialmente.

polare e poi man mano sempre più apolare. Effetto del gradiente sulla separazione. Ordine di eluizione degli analiti: 1) analita più polare, 2) analita mediamente polare, 3) analita polare. A= fase mobile acquosa; B= eluente organico.

- Isocratica (giallo) – buona separazione, tempi lunghi

- Gradiente 0-100 (rosso) – buona separazione, tempi più brevi aumento pian piano l'apolarità del solvente (es: aggiungo acetonitrile all'acqua, finché la concentrazione dell'acetonitrile è 100%)

- Gradiente 30-100 (verde) – cattiva separazione, tempi più brevi parto da una concentrazione al 30% di aceto nitrile e la aumento gradualmente finché non arrivo al 100% rischio di far sovrapporre colonne (quindi di non separare gli analiti)

6. Cromatografia a scambio ionico

Se ho sostanze non cariche, neutre, non posso utilizzare lo scambio ionico. Se ho molecole cariche posso utilizzarlo, attraverso

L'interazione con delle particelle cariche. Si tratta di un sistema cromatografico in grado di separare analiti presenti come anioni o cationi, che si avvale della presenza di uno scambiatore ionico: è supporto cromatografico funzionalizzato con ioni che costituiscono siti fissi di carica positiva o negativa; a questi siti fissi "di scambio" si legano anioni o cationi per mantenere l'elettroneutralità del sistema ("controioni"). Gli analiti interagiscono col supporto, scalzando i controioni e sostituendoli.

La fase stazionaria è costituita da una resina polimerica opportunamente funzionalizzata. Le resine possono essere:

• Cationiche, funzionalizzate con gruppi solfonici (SO3H) [resine tipo acido forte]; gruppi acidi carbossilici (R-COO-H+) [acido debole];
• Anioniche, funzionalizzate con ammine quaternarie (R-N(CH3)3+OH-) [base forte]; ammine secondarie o terziarie [base debole]

La resina deve avere carica opposta.

1. Diffusione dello ione alla superficie della resina e attraverso la matrice della resina verso il sito di scambio.
2. Spiazzamento del controione (che è appoggiato in maniera labile per controbilanciare la carica) al sito di scambio: quanto maggiore è la carica della molecola da scambiare, tanto più forte è il legame con la resina e tanto meno facilmente essa può essere sostituita da altri ioni.
3. Diffusione del controione attraverso la resina.
4. Distacco selettivo, a opera di un eluente, e diffusione della molecola nella soluzione esterna.

leghino.L'eluizione si ottiene, poi, mediante un gradiente in cui aumentano gradualmente pH e forza ionica.Questi principi si realizzano nell'apparecchiatura automatica, nota come analizzatore di amminoacidi(detector a fluorescenza dopo derivatizzazione post colonna). Gli AA acidi (aspartico e glutamico)vengono eluiti per primi, seguiti dai neutri, (glicina e valina), mentre quelli basici, (lisina e arginina)mantengono la carica positiva fino a pH 9-11 e vengono eluiti per ultimi.

Separazione di carboidrati

• Si utilizzano scambiatori anionici costituiti da gruppi amminici quaternari che funzionano dabase forte.
• Si lavora a pH basico (NaOH) in modo che le molecole dei carboidrati (che hanno pKa circa12) siano dissociate e, come anioni, possano legarsi ai siti dello scambio ionico.
• Si eluisce con acetato a concentrazioni crescenti che funziona da anione competitore e spiazzagli analiti.
• Rivelazione amperometrica pulsata (PAD)

7. Cromatografia di esclusione

La cromatografia molecolare (sterica) è definita anche gel permeazione, quando per l'eluizione si utilizza un solvente organico anziché solventi acquosi. Ha come prerogativa il fatto che la fase mobile non interagisce con le sostanze da separare ma semplicemente le trasporta. La fase stazionaria è un supporto inerte che presenta pori di dimensioni controllate. I soluti con un volume maggiore dei pori della fase stazionaria (ovvero con un peso molecolare molto elevato) usciranno dalla colonna con il fronte del solvente, i soluti che invece hanno dimensioni minori rispetto al diametro e alla superficie dei pori saranno trattenuti dalla colonna per un tempo proporzionale al peso molecolare del soluto stesso. L'ordine di eluizione va di pari passo con l'ingombro sterico. Conoscere l'ordine di eluizione può essere utile per stabilire il peso molecolare di una specie incognita. La cromatografia di esclusione sterica è utile in campo farmaceutico per la separazione.

GASCROMATOGRAFIA

La gascromatografia è una tecnica di analisi che consente di separare, uno per uno, i diversi componenti di una miscela. Si può applicare sia a campioni di gas, sia a liquidi, sia a solidi purché riconducibili allo stato di vapore entro certi intervalli di temperatura. La fase mobile è un gas che fluisce attraverso una colonna in cui si trova la fase stazionaria; secondo lo stato fisico della fase stazionaria, la gas-cromatografia si può suddividere in:

• Cromatografia gas-liquido: fase stazionaria liquido trattenuto sulla superficie di un solido inerte mediante adsorbimento o legame chimico (film pellicolare). La colonna è rivestita dal film pellicolare.
• Cromatografia gas-solido: fase stazionaria solido che trattiene gli analiti mediante adsorbimento fisico. Questo tipo di cromatografia

è datata e poco utilizzata al giorno d’oggi.

Requisiti analiti per gascromatografia:

• devono essere volatili ad alte temperature (fino a 200 gradi)
• devono essere termostabili (non si devono denaturare)

Sistema di erogazione del gas di trasporto (carrier):

Una bombola contiene il gas di trasporto compresso. Il gas può essere: elio (He), argon (Ar), azoto(N ), idrogeno (H ), anidride carbonica (CO ). La composizione della fase mobile non può quindi2 2 2essere cambiata a piacimento come in altri tipi di cromatografia, una volta che la bombola è collegataal macchinario utilizzo quel gas di trasporto. L’unico parametroregolabile è il flusso di gas (che solitamente viene regolatoall’inizio quando la bombola viene installata e poi non viene piùmodificato). C’è un filtro tra il regolatore della pressione e lostrumento che serve a trattenere la condensa che si potrebbeformare e altre sostanze estranee.

Flussi utilizzati:

à29/150 mL/min colonne impaccate.

à1/25 mL/min colonne capillari

Iniezione del campione:

1. Sistema di introduzione diretto (on column):

L’iniettore permette di iniettare il campione senza interferire col movimento del gas che sta scorrendo. L’iniettore è inserito sopra l’ingresso della colonna. È come una “camera” in cui è presente un foro attraverso il quale si può inserire la siringa e iniettare il campione (solitamente un microlitro). Questa “camera” è inserita in un blocco riscaldato opportunamente per favorire l’immediata volatilizzazione del solvente e del campione. La camera dell’iniettore è collegata con l’ingresso della colonna. La fase mobile entra nella camera e forza la soluzione gassosa contenente gli analiti ad entrare in colonna.