Appunti di Fermentazioni industriali

MACRONUTRIENTI:

Fonti di azoto (nitrati e/o ammonio), fosforo (come tamponi fosfato), potassio, calcio (impiegato in concentrazioni maggiori rispetto a quanto previsto nei terreni per microrganismi) e zolfo.

MICRONUTRIENTI:

Elementi presenti in tracce, necessari per lo sviluppo. Simili a quelli impiegati nei terreni formulati per lo sviluppo microbico (trace elements), con l'aggiunta di ioduro di potassio (KI, stimola lo sviluppo cellulare).

VITAMINE:

Anche se le piante generalmente riescono a sintetizzare tutte le vitamine necessarie per lo sviluppo, queste sono comunque contemplate nella formulazione del terreno colturale, soprattutto la tiamina.

REGOLATORI DELLO SVILUPPO (fitormoni):

Vengono impiegati sia gli ormoni naturalmente presenti nelle piante, che altre molecole di sintesi, analoghi strutturali che si legano agli stessi recettori degli ormoni naturali:

• auxine, promuovono lo sviluppo della pianta (es. acido indolacetico)
• citochine, favoriscono la duplicazione cellulare, e incrementano

La formazione di metaboliti secondari (es. zeatina)

ALTRI INGREDIENTI:

Il terreno colturale può contenere anche ingredienti complessi: latte di cocco, estratto di lievito, succhi di frutta, idrolizzato di caseina. Forniscono vitamine e amminoacidi necessari per lo sviluppo.

Temperatura di fermentazione: generalmente 25°C. Alcune specie possono crescere anche a 30°C (es. Nicotiana tabacum).

LUCE

La formazione del callo e la coltura in liquido non richiedono luce per lo sviluppo cellulare. Se viene fornita, le colture possono diventare verdi (formazione di cloroplasti) o marroni (accumulo di polifenoli). La presenza di luce può inibire l'accumulo di metaboliti secondari. La luce è importante solo quando è necessario rigenerare la piantina.

ALCUNI METABOLITI SECONDARI DERIVANTI DA CELLULE VEGETALI, PRESENTI SUL MERCATO

Composto	Impiego	Pianta
Cocaina	Anestetico	Erythroxylon coca
Atropina	Anticolinergico	Datura stramonium
Vincristina	Antileucemico	Catharanthus

roseusPiretrina Insetticida PyrethrumChinino Antimalaria/aroma ChinchonaCodeina Analgesico Papaver somniferumLe cellule vegetali possono essere impiegate in un processo biotecnologico, secondo tre sistemi diversi:1. Cellule in sospensione2. Cellule immobilizzate3. Colture di strutture organizzate di una piantaBIOREATTORI E SCALE-UPLe colture di cellule vegetali vengono allestite nei bioreattori più comunemente impiegati anche per lo sviluppo microbico.Ci sono però due aspetti da tenere presente:1. Le cellule vegetali sono molto sensibili agli attriti, soprattutto a quelli generati dal sistema di agitazione meccanica.E' possibile ovviare a questo inconveniente:- diminuendo l'angolo delle palette della turbina- impiegando un sistema di agitazione ad elica marina- utilizzando un fermentatore air-lift2. L'aspetto della coltura può essere molto eterogeneo:- gli aggregati di dimensioni maggiori tendono a depositarsi sul fondo del reattore- gli aggregati

più piccoli tendono ad aderire alle pareti del reattore o e flottare sulla schiuma, creando uno strato definito “a meringa” sulla parte superiore della coltura.

3. Il tempo di duplicazione delle cellule vegetali è elevato (15 h per le più veloci):- fattore che incide notevolmente sull’economicità del processo fermentativo- difficoltà di mantenere la sterilità per tempi prolungati.

STIRRED TANK REACTOR (STR)

Reattore più comunemente usato.

Max volume: 20.000 L

coltivazione di cellule di Nicotiana tabacum (tabacco): 16 g/L biomassa

INCONVENIENTI:

Provoca un danno meccanico alle cellule, dovuto al sistema di agitazione.

AIR LIFT BIOREACTOR

L’agitazione della coltura viene mantenuta grazie all’aerazione, fornita dal basso

PRODUZIONE DI METABOLITI SECONDARI

I metaboliti secondari estratti dalle piante sono numerosi e da tempo impiegati nel settore farmacologico:

• codeina e morfina (antidolorifici) dal papavero da oppio

(Papaver somniferum);• atropina, scopolamina (neuroregolatori) e chinino (antimalaria) da Chincona sp.;• diosgenina e digossina (cardiotonici) da Digitalis sp.
Tradizionalmente queste molecole venivano prodotte facendo crescere le piante e quindi estraendo la molecola. Il processo produttivo era stagionale e soggetto a variazioni climatiche, ma anche agli interessi politici delle regioni in cui le piante venivano coltivate (vedi papavero da oppio). La possibilità di mettere a punto un processo fermentativo con cellule vegetali, anziché aspettare lo sviluppo della pianta, riduce notevolmente i tempi di processo, e semplifica spesso le procedure di downstream.

L13 - IMMOBILIZZAZIONE
L’attenzione per i sistemi immobilizzati è stata inizialmente rivolta agli enzimi. L’immobilizzazione delle cellule microbiche è recente e ha assunto notevole importanza come alternativa agli enzimi. Non esiste una procedura universalmente impiegabile per l’immobilizzazione.

Delle cellule microbiche

In natura sono presenti numerosi esempi di cellule, in grado di colonizzare supporti diversi come conseguenza dello sviluppo. La produzione di aceto (metodo tedesco) costituisce invece il primo esempio storico di impiego di cellule immobilizzate.

Vantaggi:

• facilità di processo in caso di reazione multistep
• separazione e reimpiego delle cellule facilitato
• alta stabilità dell'attività catalitica
• possibilità di operare ad alta concentrazione cellulare. Si possono aggiungere molti più mo di quelli in forma libera.
• possibilità di ottenere aggregati di dimensioni ottimali

Requisiti:

• procedura innocua per la cellula microbica, l'operatore, l'impianto e l'utilizzatore finale
• tecnologia semplice
• ottenimento di un sistema immobilizzato che abbia lunga vita
• procedura economica

Aggregazione: sistema immobilizzato più semplice, sfrutta la naturale tendenza di alcune cellule ad aggregarsi ad es.

Saccharomyces cerevisiae nella produzione di etanolo. Cellula di lievito Colonizzazione: Principio su cui si basa la formazione di un film su materiale solido > colonizzazione di un materiale poroso conseguenza della naturale tendenza delle cellule ad aderire ad un supporto. Dipende dalla capacità delle cellule di interagire con un supporto solido. Processo di tipo passivo > la densità cellulare dipende dal tipo di supporto scelto con approccio empirico, per tentativi (ad es. plastica, poliuretano, acciaio...). Lo spessore del film cellulare dipende dal flusso della fase liquida > supporto effetto abrasivo del liquido azione abrasiva spessore. A flusso costante si ha equilibrio tra le cellule che si sviluppano e del film cellulare quelle asportate > spessore del film costante. Lo spessore del film può variare da 0,001 a 3-4 mm. Adsorbimento: Adesione della cellula alla superficie di un carrier dovuta ad interazione elettrostatica (forze di Van der Walls). Spessoassociata alla presenza di mannani sulle pareti.
es. cellule di lievito adsorbite
L'adsorbimento è basato sull'instaurarsi di un legame covalente tra un supporto attivato e la cellula.
Legame stabile si mantiene inalterato per lunghi periodi di tempo con minime perdite di cellule, per effetto del flusso della fase liquida.
NOTA In alcuni casi, nel corso della formazione del legame, può risultare danneggiata l'attività catalitica o compromessa la vitalità della cellula.
Intrappolamento: Più studiata procedura di immobilizzazione applicata ai microrganismi. Le cellule microbiche sono miscelate all'agente immobilizzante, prima che avvenga la polimerizzazione.
Sono stati valutati polimeri:
a. Sintetici: poliacrilammide - resine epossidiche - poliestere - poliuretano
b. naturali: agar - alginato - carragenine - collagene - gelatina
I pori del gel hanno dimensioni tali da consentire la diffusione dei nutrienti e delle cellule nel prodotto ma

non la fuoriuscita delle cellule. Non si ha legame tra cellula e matrice polimerica, contenuti rischi di danneggiamento dell'attività e della vitalità cellulare. nutriliti (e ossigeno)

Polimeri sintetici

La poliacrilammide è stato il polimero sintetico più studiato. Polimerizza e forma gel con porosità variabile funzione del rapporto acrilammide/bisacrilammide. Le condizioni operative possono essere critiche per la vitalità cellulare: il monomero, prima della polimerizzazione, presenta alti livelli di tossicità per l'operatore e, in alcuni casi, anche per le cellule microbiche. Si ottengono immobilizzati a costi elevati e con scarsa resistenza meccanica

Polimeri naturali

Il polisaccaride più conosciuto in ambito microbiologico è l'agar scarsi risultati, in funzione della: limitata resistenza meccanica ne condiziona l'impiego su larga scala. K carragenina (associata a glutaraldeide) sono stati ottenuti

immobilizzati con caratteristiche soddisfacenti, sviluppo di alcuni processi industriali (produzione di acido aspartico da Escherichia coli). L'alginato ha fornito i migliori risultati sia nei confronti delle caratteristiche dei sistemi immobilizzati ottenibili sia delle possibili applicazioni industriali. Immobilizzazione delle cellule microbiche: in condizioni blande consentono di ottenere sistemi con alta vitalità. Contenimento in sistemi semipermeabili: le cellule non sono immobilizzate in senso stretto, ma confinate tramite membrana semipermeabile. I pori della membrana, dell'ordine del micron, consentono il passaggio del substrato e del prodotto, ma non quello delle cellule. Conservazione colture microbiche e processi industriali: operazioni fondamentali per lo sviluppo di un processo biotecnologico: isolamento coltura > mantenimento. Quindi, esaurita la fase di screening si pone il problema: come conservare le colture selezionate? Tra le diverse opzioni di conservazione, l'immobilizzazione delle cellule microbiche in sistemi semipermeabili come l'alginato offre risultati soddisfacenti sia in termini di vitalità delle cellule sia di applicazioni industriali.ù adatta. Tuttavia, ci sono alcuni principi generali che possono essere seguiti per garantire una buona conservazione delle colture. 1. Temperatura: la temperatura di conservazione dipende dal ceppo specifico e dalle sue esigenze. In generale, le colture batteriche vengono conservate a temperature tra 4°C e -80°C. Le colture fungine possono essere conservate a temperature leggermente più alte, tra 4°C e -20°C. 2. Mezzo di conservazione: le colture possono essere conservate in diversi tipi di mezzi, come agar, brodo o glicerolo. Il mezzo scelto dipende dalle esigenze specifiche del ceppo e dal tipo di conservazione desiderato. Ad esempio, il glicerolo può essere utilizzato per la conservazione a lungo termine a basse temperature. 3. Contaminazione: è importante evitare la contaminazione delle colture durante la conservazione. Pertanto, è necessario lavorare in un ambiente sterile e utilizzare tecniche aseptiche durante la manipolazione delle colture. 4. Etichettatura: ogni coltura conservata deve essere correttamente etichettata con informazioni importanti come il ceppo, la data di conservazione e le condizioni di conservazione consigliate. 5. Controllo periodico: è consigliabile controllare periodicamente le colture conservate per verificare la loro vitalità e purezza. Questo può essere fatto attraverso test di crescita o analisi genetiche. Seguendo questi principi generali, è possibile garantire una buona conservazione delle colture industriali, mantenendo alta vitalità e stabilità nel tempo.