Appunti di Fermentazioni industriali

Scienze e tecnologie alimentari magistrale - UniMi

Appunti di lezioni di: Biotecnologie microbiche: Fermentazioni industriali

Corso biotecnologie microbiche

Modulo 2: Fermentazioni industriali

Esame:

• Produzione di un acido organico (lattico - glucosio - citrico)
• Coltura batch, fed-batch o continua (metodi per controllare le colture)
• Un altro argomento (immobilizzazione, bireattori non convenzionali)

Laboratori:

L0 - Introduzione

L'uomo ha sfruttato la capacità fermentativa dei microrganismi da migliaia di anni. La prima applicazione, come bevanda alcolica, risale ai Sumeri circa 6.000 anni a.C. Sono state trovate indicazioni che già gli Egiziani usassero lieviti per la produzione di pane. Ha avuto così inizio lo sviluppo delle applicazioni della biotecnologia fino ai moderni processi industriali -> biotecnologia.

Congiunzione di due distinti sostantivi: Biologia e Tecnologia

• Il primo: studio e conoscenza (logos) degli esseri viventi (bios) e delle leggi che li governano.
• Il secondo (techné): applicazione e uso di strumenti tecnici applicabili per la soluzione di problemi pratici e per l'ottimizzazione di procedure per la produzione di beni e servizi.

I moderni processi microbiologici sono basati sulle biotecnologie:

• applicate ai microrganismi
• applicate ai parametri di processo

Il termine generico di biotecnologia identifica una scienza interdisciplinare e coinvolge molti campi della ricerca [microbiologia, biochimica, biologia molecolare, biologia cellulare, immunologia, ingegneria delle proteine, enzimologia, tecnologie dei bioprocessi..] e può essere applicata in molti settori [alimentare, agricolo, ambientale, diagnostico..].

Per biotecnologia si intendono tutti gli impieghi di sistemi biologici costituiti da singole cellule o loro componenti per ottenere beni o servizi. In funzione delle applicazioni, distinguiamo tipologie differenti di biotecnologia:

Biotecnologia rossa - processi biomedici e farmaceutici

• Individuazione di organismi in grado di sintetizzare molecole ad attività farmacologica
• Statine: molecole ad attività anticolesterolemica
• Insulina
• Antibiotici
• Sviluppo di tecnologie di ingegneria genetica per la cura di patologie
• Editing genetico (sostituzione di geni mutati coinvolti in patologie)

Biotecnologia bianca - processi biotecnologici di interesse industriale

Microrganismi in grado di produrre composti e/o enzimi per specifiche reazioni. In competizione con i processi chimici tradizionali: costi generalmente inferiori e minor impatto ambientale. La produzione di enzimi è un settore trainante delle biotecnologie bianche, in quanto il fatturato annuo, tra i vari comparti industriali, risulta il più elevato.

Biotecnologia verde - agricoltura-ambiente

Tutte le applicazioni collegate all'agricoltura, come la sintesi di biofertilizzanti e bio-fitofarmaci in grado di limitare l'impatto sull'ambiente senza ridurre la propria efficacia. -> Produzione di soluzioni agricole con minor impatto ambientale rispetto ai processi agricoli classici. L'applicazione di biotecnologie sulle coltivazioni può portare a un miglioramento delle caratteristiche richieste dal mercato (es. tempi di conservazione più lunghi, maggiore produttività e resistenza ai parassiti). Esempio: piante "ingegnerizzate" in grado di produrre pesticidi, eliminando la necessità di somministrazione esterna (esempio: mais BT – tossina B. thuringiensis). Ampio dibattito sull'eco-compatibilità di questi processi e sulla sicurezza di impiego in agricoltura di organismi geneticamente modificati (OGM).

Biotecnologia blu

Applicazioni della biotecnologia in campo marino: sfruttamento di microrganismi isolati da habitat marini/acquatici. Sulla base delle procedure impiegate possiamo distinguere:

1. Biotecnologie tradizionali

Tecnologie produttive utilizzate da millenni nei settori alimentare, agricolo e zootecnico sfruttando le attività fermentative dei microrganismi. Es. Le biotecnologie tradizionali trattano tipicamente tecnologie produttive utilizzate da millenni, e riguardano in particolare l'agricoltura, la zootecnica, lo sfruttamento delle attività fermentative dei microrganismi e le trasformazioni biologiche in genere.

2. Biotecnologie innovative

Tecnologie che prevedono la manipolazione del materiale genetico (ingegneria genetica) con numerose applicazioni in ricerca scientifica e settori industriali. Le innovazioni in questo settore possono essere utilizzate anche in processi tradizionali. Esempio: produzione di prodotti in cui è possibile impiegare ceppi di microrganismi geneticamente modificati.

Le biotecnologie rappresentano un'area fortemente trasversale -> impatto nei diversi comparti produttivi:

• Tradizionali (alimentare, farmaceutico, medico)
• Innovativi (ambientale, diagnostica, energia)

«Efficace azione di alfabetizzazione scientifica sulle potenzialità e i rischi delle biotecnologie, in modo da creare un confronto aperto e democratico per sviluppare delle normative che indirizzino verso una buona pratica di impiego delle biotecnologie, mirata al progresso scientifico e al benessere della umanità tutta, in grado di:

• Tutelare i diritti individuali
• Evitare qualsiasi discriminazione sociale
• Rispettare l'ambiente e la biodiversità
• Valorizzare le ricadute economiche in termini sia di prospettive di sviluppo imprenditoriale, sia di nuove opportunità lavorative, sia per coniugare i valori del mercato con quelli di un'etica della salute mondiale»

Sviluppi possibili

Dall’attività di ricerca in funzione del sistema produttivo con il coinvolgimento delle imprese per la progettazione e realizzazione dell’innovazione > creazione di condizioni favorevoli per gli investimenti industriali nei settori emergenti. La ricerca Universitaria non è finalizzata a se stessa, ma orientata verso applicazioni pratiche su larga scala collaborando con le aziende.

La competizione

Requisiti per l’ottenimento di un bioprodotto:

• Al fine di ottenere l'attività metabolica ottimale > controllo rigoroso de: composizione del terreno colturale - temperatura - pH.
• Mantenimento della sterilità
• Controllo dell’idrodinamica del bioreattore > mantenimento omogeneità della brodo coltura per adeguato rifornimento di aria e di nutriliti

Le fasi

Recupero del prodotto (spesso diluito) dal terreno colturale (spesso complesso)

• Purificazione del prodotto in funzione del grado di purezza desiderato
• Prodotto isolato in forma stabile
• Recupero dei costi; processo economico
• Minimo rischio per personale ed impianto

L1 - Metabolismo aerobio e anaerobio

Metaboliti primari sono molecole più semplici mentre i metaboliti secondari sono tutte matrici d'accumulo e più complessi. Le capacità biochimiche dei microrganismi sono vastissime > ampia gamma di nuove molecole possono essere ottenute in processi microbiologici.

Metabolismo anaerobico: prodotti finali del metabolismo > spontaneamente accumulati (ad es. acidi lattico, butirrico, propionico..)

Metabolismo aerobico: intervenendo con opportune strategie > si possono ottenere accumuli di intermedi metabolici

• Costituenti cellulari: sintetizzati in eccesso rispetto alle esigenze fisiologiche, accumulati all'interno o all'esterno della cellula (acidi organici, aminoacidi, nucleotidi e loro derivati, lipidi, vitamine ...)
• Metaboliti accumulati all'esterno della cellula: non è sempre possibile attribuire un significato metabolico e una funzione (antibiotici, alcaloidi, polisaccaridi ...)

Il metabolismo microbico è costituito da:

• Fase catabolica (degradazione)
• Fase anabolica (biosintesi)

Produzione di energia necessaria per i processi vitali ottenuta dalla trasformazione degradativa dei nutriliti. Le reazioni sono regolate da meccanismi di controllo il cui scopo principale è indirizzare l’intero metabolismo verso lo sviluppo cellulare.

Metabolismo anaerobico: processi catabolici e anabolici

Nel metabolismo anaerobio si ha generazione di bassi livelli di energia (ATP). Il substrato viene in larga misura utilizzato nella fase catabolica, formazione di limitati livelli di energia utilizzati nella fase anabolica. Accumulo spontaneo di metaboliti, generalmente finali. Rigenerazione del potere riducente (NADH a NAD) è ottenuta per trasferimento degli elettroni e degli atomi di idrogeno non all’ossigeno ma ad altre molecole che vengono ridotte e accumulate come tali (prodotti finali) (ad es. acido piruvico a dare acido lattico).

Una limitata quota di substrato è utilizzata per il catabolismo con conseguente possibilità di sostenere la fase anabolica a livelli elevati. L’energia generata (ATP) è significativamente superiore rispetto a quella ottenibile dal metabolismo anaerobico. Il NADH (potere riducente) è riossidato per trasferimento degli elettroni all’ossigeno che funge da accettore terminale.

Considerazioni sugli aspetti metabolici

I prodotti del metabolismo anaerobico sono principalmente costituiti da metaboliti generalmente finali spontaneamente accumulati (anche in livelli significativi ) e cellule in misura limitata. I prodotti finali del metabolismo aerobico sono principalmente costituiti da cellule, anidride carbonica e acqua senza che si abbiano significativi accumuli di intermedi metabolici.

Strategie

Con opportune procedure è possibile ottenere ceppi in grado di fornire elevati livelli di metaboliti non spontaneamente accumulabili. La conoscenza dei meccanismi enzimatici è fondamentale per poter alterare il metabolismo microbico e regolare i processi fermentativi. L’impiego di un terreno sbilanciato può produrre effetti che possono portare all’accumulo di metaboliti.

La produzione di metaboliti dipende da caratteristiche genetiche adatte che tuttavia non sono sufficienti per l’ottenimento di accumuli > la cellula dispone di meccanismi di regolazione efficienti che impediscono l’accumulo di intermedi in eccesso rispetto alle normali esigenze cellulari. Gli accumuli sono ottenuti con approcci basati sul controllo dell’attività enzimatica: sintesi o attività.

Sintesi degli enzimi

• Enzimi costitutivi sono sempre formati
• Enzimi inducibili sono sintetizzati solo in presenza di un induttore (elemento presente nel terreno colturale) (es. amilasi, composti che inducono nel microrganismo la sintesi degli enzimi che vogliamo produrre. Per fare produrre amilasi, dobbiamo mettere intenzionalmente amido).

Attività degli enzimi

La concentrazione di metaboliti è funzione dei sistemi di controllo dell’attività enzimatica.

• Inibizione. Fenomeno che agisce sul bloccare così da non farlo lavorare.
• Repressione. Mentre se si reprime, significa bloccare la sintesi.

La via metabolica lineare

I meccanismi di inibizione e repressione agiscono in sinergia nel controllo delle vie metaboliche

Inibizione a feedback. Quando P si accumula in concentrazioni importanti, crea inibizione delle attività sul primo enzima della via metabolica. Questo è un metabolismo fisiologico. Inibizione esplicata dal prodotto finale sull’attività del primo enzima della via metabolica. Potrebbe anche regolare E1, E2, E3 avviene una repressione di tutti e tre gli Enzimi. Repressione esplicata dal prodotto sulla sintesi di uno o più enzimi della via metabolica.

La via metabolica ramificata

I metaboliti prodotti in una via ramificata non sono generalmente necessari in livelli analoghi e quindi sono sintetizzati in diversa concentrazione. P1 + P2 agiscono su E1 con un’azione di inibizione o di repressione (o di entrambe).

Inibizione sul primo enzima della catena (E1) esplicata da elevati livelli di uno solo dei prodotti (P1 o P2). Inibizione dei singoli prodotti (P1 e P2) sul primo enzima della rispettiva via metabolica dopo la ramificazione (E2 e E3). Meccanismo che permette l’accumulo di uno dei due prodotti in funzione delle esigenze della cellula. Modificazione della permeabilità cellulare favorisce la fuoriuscita di un metabolita sintetizzato e accumulato P all’interno della cellula P.

Esempio: acido glutammico. Il mo viene alterato in permeabilità della membrana, P esce e la cellula pensa che sia sempre basso il livello di P, così continua a produrlo.

Blocco metabolico

Il microrganismo diventa incapace di sintetizzare il prodotto finale i cui livelli controllano l’attività di un enzima con ruolo chiave sulla via metabolica. Rimozione dei fenomeni di inibizione/repressione si rende il microrganismo insensibile alla presenza di livelli di prodotto che causano inibizione o repressione.

Accumulo metabolita non associato allo sviluppo

Processo suddiviso in due fasi:

• Trofofase: fase di sviluppo (fino all’esaurimento della fase logaritmica)
• Idiofase: fase di biosintesi (che inizia nella fase stazionaria). Perché ci sia accumulo devono esserci due condizioni: impiego di un idoneo terreno colturale e il microrganismo deve avere caratteristiche genetiche adatte.

Accumulo prodotti del metabolismo secondario

Sintesi nella idiofase, di prodotti finali non essenziali per lo sviluppo del microrganismo, a partire da metaboliti primari. Fase biosintetica attraverso vie metaboliche non utilizzate dalla cellula nella fase di sviluppo. Gli enzimi responsabili della biosintesi dei metaboliti secondari sono repressi durante la trofofase. L’isolamento di ceppi meno sensibili all’inibizione da prodotto consente di ottenere ceppi in grado di fornire più alte rese di prodotto.

Metaboliti primari: lo studio dei meccanismi legati all’accumulo è facilitato, molecole con comprensibile significato per la cellula microbica.

Metaboliti secondari: indagine complessa, utile biogenesi > La conoscenza della struttura chimica consente di ipotizzare da quali molecole più semplici sono sintetizzati i metaboliti secondari.

L'impiego di isotopi nel terreno colturale può portare all’individuazione delle vie metaboliche dei microrganismi. Gli isotopi possono emettere radiazioni (radioisotopi, isotopi artificiali), oppure avere differente peso atomico (isotopi naturali). Viene valutata l’incorporazione di isotopi nei metaboliti isolati. Dalla fine del XIX secolo si è cercato di capire i meccanismi delle reazioni biosintetiche utilizzando, quali composti di partenza, molecole semplici quali ad esempio carboidrati e amminoacidi, la procedura di scomporre la struttura di una molecola complessa nelle sue probabili unità strutturali prende il nome di biogenesi.

L2 - Processi biotecnologici

L'EFB (European Federation of Biotechnology) ha definito la biotecnologia come uso integrato di biochimica, microbiologia e ingegneria allo scopo di perseguire l'applicazione tecnologica-industriale della capacità dei microrganismi, delle colture di cellule di tessuti o di loro parti > l’uso controllato di materiale biologico > controllo del processo biotecnologico per impiego di microrganismi.

I processi biotecnologici servono per ottenere:

• Biomasse
• Molecole sia extra (la cellula produce la molecola e la riversa nella parte liquida della coltura) sia intra (accumulo all’interno della cellula) - cellulare
• Prodotti ottenuti per biotrasformazione (utilizziamo il mo per trasformazione di un composto in un altro composto es. da glucosio ad acido gluconico). Si attuano delle trasformazioni selettive che con i catalizzatori non sarebbero possibili.

Schema generalizzato di un processo di fermentazione industriale:

Il terreno viene mescolato nel serbatoio e poi passa nel fermentatore dove viene sterilizzato. Una volta sterilizzato, viene effettuato l’inoculo. Successivamente si ferma l’impianto. Dal fermentatore la coltura viene spostata e generalmente si separa la biomassa solida (mo cresciuto) rispetto alla parte liquida. Dalla fase di preparazione del terreno fino al fermentatore, abbiamo fasi di upstream. Dallo spegnimento del fermentatore alla vendita del prodotto, abbiamo fasi di downstream.

Elementi essenziali da non trascurare nella messa a punto di un bioprocesso

Upstream:

• Recupero delle materie prime
• Sviluppo
• Mantenimento e controllo delle colture = è fondamentale avere un laboratorio di microbiologia dove studiare il mo in modo da evitare l’inquinamento delle colture. Inoltre si mantengono le colture per anni. Questi accorgimenti per: per ottenere un prodotto definito e gestire una biotrasformazione.

Downstream:

• Operazioni a fine processo. Questi accorgimenti per: il recupero, l’isolamento e la purificazione del prodotto.

Nel corso della fermentazione è obbligatorio controllare:

• Controllo rigoroso composizione del terreno colturale: pH - temperatura - controllo viscosità (soprattutto nei terreni con ife fungine).
• Controllo idrodinamica
• Mantenimento sterilità
• Costi! Recupero prodotto dal brodo di coltura che a fine del processo può essere viscoso, complesso e difficile da gestire.

A fine processo > downstream

Brodocoltura: sospensione di cellule o micelio in una fase liquida. Microrganismo unicellulare: sospensione uniformemente torbida. Microrganismo miceliare: Pellet (strutture raggruppate, ifa esterna e interno cavo. Da pochi mm a cm) o micelio lasso. Es. Monascus purpureo - micelio lasso. L’ifa mentre si sviluppa, frammenta e non riavvolgendosi la coltura è densa. Più difficile da recuperare.

Recupero del prodotto

A) Per vendita biomassa > separazione:

• Spegnimento del fermentatore e dell’agitazione con sedimentazione spontanea (sedimentazione per gravità). Processo lento
• Filtrazione dall’alto attraverso...