Appunti Biochimica applicata

CROMATOGRAFIA DI AFFINITÀ

Si basa sull’estrema specificità delle interazioni biologiche.

La fase stazionaria contiene una molecola immobilizzata che si lega con alta specificità ad una

singola proteina o a un piccolo numero di proteine simili, acidi nucleici o altre molecole.

Ad esempio sulla FS può essere immobilizzato l'Ag di un Ab se voglio purificare questo o

viceversa.

Oppure può essere immobilizzato il substrato di un enzima se voglio purificare quest'ultimo.

La cromatografia di affinità può in teoria garantire una purificazione completa della sostanza in un

solo passaggio, anche a partire da miscele complesse.

Questo perché, a differenza delle altre due tecniche cromatografiche che si basano su PM e carica

delle proteine, si basa su interazioni biologiche specifiche.

Quindi essa è la tecnica di elezione per la sua specificità e perché richiede poco tempo.

In realtà NON si ottiene mai la proteina pura in un solo passaggio.

NON sempre le proteine presentano un ligando biologico specifico.

Pertanto, fatta eccezione per Ab e enzimi, la cromatografia di affinità è difficile per la maggior parte

delle proteine.

Le cromatografie per gel filtrazione e scambio ionico si basano su interazioni chimico-fisiche non

specifiche tra un supporto stazionario e un soluto.

Caratteristiche molecolari come carica netta o dimensioni non offrono una base per un’elevata

selettività, necessaria per la separazione e la purificazione di biomolecole (esistono infatti numerose

proteine che hanno la stessa carica, lo stesso PM oppure lo stesso PM e carica

contemporaneamente).

Quindi sono tecniche poco selettive.

La cromatografia di affinità è l’unica tecnica cromatografica che consente questa specificità perché

si basa su interazioni biologiche.

Ma come funziona questa tecnica cromatografica?

A livello della FS viene immobilizzato, mediante legame covalente, il ligando della proteina da

purificare.

Solitamente tra il ligando e la FS si posiziona un braccio spaziatore in modo che il ligando possa

interagire con la proteina presente nel campione.

Un ligando non può essere direttamente legato alla FS (matrice/resine) perché questo può

influenzare il legame tra ligando e molecola presente nel campione.

Nella FM si inserisce la miscela contenente l'enzima che deve essere purificato.

La FM passa attraverso la FS e l'enzima lega il proprio substrato in modo specifico; l'enzima viene

quindi immobilizzato all'interno della FS.

In seguito al legame tra enzima e FS, si effettuano dei lavaggi estensivi per rimuovere le proteine

che si sono legate in modo aspecifico (mediante interazioni idrofobiche aspecifiche) alla FS.

Infine, si eluisce (si distacca) la proteina di interesse dalla FS aggiungendo un eccesso di ligando

(uguale a quello legato alla FS); infatti, si instaura una competizione per la proteina di interesse tra

il ligando libero e quello legato alla FS che consente il distacco della proteina.

Infine, l'eccesso di ligando viene rimosso attraverso una reazione di dialisi, ponendo l'eluito in una

membrana semipermeabile che si trova in un ambiente privo di substrato.

Questo è uno schema generale della cromatografia ad affinità (che si basa su interazioni biologiche)

Alcuni concetti chiave della cromatografia di affinità

In chimica e biochimica, la costante di dissociazione (Kd) esprime la tendenza di un composto a

dissociarsi nelle sue componenti (cioè a scindersi per formare altri composti costituiti da molecole

aventi un peso molecolare minore rispetto alle molecole del composto di partenza).

Kd è comunemente utilizzata per descrivere l’affinità tra un ligando e una proteina; essa si usa, per

esempio, per descrivere quanto è forte il legame tra un ligando L e una particolare proteina P.

Le affinità ligando-proteina sono influenzate da interazioni intermolecolari non covalenti (quindi

reversibili) tra le due molecole, come:

legami a idrogeno

• interazioni elettrostatiche

• forze di Van der Waals

• idrofobicità

•

Questi sono i tipi di legame coinvolti nelle interazioni di affinità (sono legami non covalenti).

La formazione di un complesso ligando-proteina (C) è descritta dalla reazione reversibile:

C P + L

nella quale la corrispondente costante di dissociazione è definita come:

La Kd ha come unità di misura la molarità quindi è una concentrazione.

La costante di dissociazione Kd ha unità molari (M), che corrispondono alla concentrazione di

ligando [L] alla quale il sito di legame di una particolare proteina è per metà occupato, ossia la

concentrazione del ligando alla quale la concentrazione delle proteine aventi il sito occupato dal

ligando [C] eguaglia la concentrazione delle proteine aventi il sito non occupato dal ligando [P].

Più bassa è la costante di dissociazione, più il ligando è fortemente legato, maggiore è l’affinità tra

ligando e proteina.

(infatti tanto più bassa è Kd tanto maggiore è la quantità di proteina legata al suo ligando ovvero

che è complessata con il ligando)

Un ligando con una costante di dissociazione nanomolare (nM) si lega più saldamente ad una

proteina con una costante di dissociazione micromolare (mM).

TAG per affinità

La maggior parte delle proteine che devono essere purificate mediante cromatografia ad affinità

NON possiede caratteristiche biologiche specifiche che possono essere sfruttate per la loro

purificazione (es Ag-Ab o substrato-enzima).

Cioè la maggior parte delle proteine non ha proprietà biologiche caratteristiche.

Quindi, solitamente, per purificare le proteine attraverso questa tecnica si procede con l'espressione

della proteina in forma ricombinante e l'associazione della stessa ad un piccolo tag che la renda

riconoscibile dalle altre proteine espresse nel sistema di interesse.

Tale tag molecolare viene associato alla sequenza che codifica per la proteina di interesse mediante

una reazione di PCR oppure inserendo la sequenza della proteina di interesse in specifici vettori di

espressione che possiedono la sequenza codificante per il tag (l'inserimento deve essere in frame

con la sequenza che codifica per il tag).

(si richiede la conoscenza della sequenza aa della proteina per poter effettuare ciò; ma questo non

costituisce un problema poiché al giorno d'oggi si conoscono quasi tutte le sequenze proteiche)

I tag possono essere inseriti all'estremità N- o C- terminale della proteina a seconda della struttura

di suddetta proteina (è possibile giocare con la biologia molecolare).

Ci sono numerose etichette che possono essere utilizzate.

I principali tag utilizzati sono:

calmodulina-binding peptide (CBP)

• 6xHis: coda di 6 istidine.

• E' il tag più utilizzato.

La coda di 6 Hys NON può essere utilizzata per la purificazione di proteine che legano i

metalli

glutatione S-transferasi (GST)

• MBP (maltose binding protein)

• strep tag (streptavidina binding tag)

•

Il tag è importante sia per la purificazione della proteina nella cromatografia ad affinità ma anche

per definire l'identità della proteina.

Ad esempio, se non è presente un anticorpo specifico per una proteina, è possibile modificare la

proteina con un tag in modo da produrre un Ab contro il tag.

Il principio cromatografico, comunque, è sempre lo stesso. Infatti, la FS è costituita da qualcosa che

lega specificamente l'etichetta e quindi trattiene (almeno in teoria), solo la proteina di interesse che

ha quel tag.

La FM trascina il soluto attraverso la FS in maniera differenziale a seconda del soluto.

Il tag è utilizzato per la purificazione della proteina di interesse. tuttavia, esso potrebbe alterare la

struttura e quindi la funzione della proteina. Quindi deve essere rimosso, solitamente attraverso

l'utilizzo di una proteasi.

IMAC: Immobilized Metal Affinity Chromaography

La tecnica IMAC è la cromatografia di affinità per i metalli immobilizzati.

Essa è molto diffusa perché è relativamente semplice.

Essa sfrutta la coda di 6 istidine per purificare una proteina ricombinante.

Questa tecnica si basa sulla capacità di alcuni aminoacidi, come l’istidina, di legarsi reversibilmente

(a valori di pH basici) a uno ione metallico, come ad esempio nichel (più frequentemente), zinco o

rame, che si trova immobilizzato da un gruppo chelante NTA (acido nitriltriacetico), a sua volta

legato covalentemente ad un supporto solido (una matrice di gel di agarosio).

La FS è un supporto solido (di solito un gel) al quale viene legato in maniera covalente NTA.

NTA chela uno ione metallico differente a seconda del tipo di IMAc che viene allestita.

Si parla di tecnologia Ni-NTA nel caso in cui lo ione metallico sia il nichel.

Due parametri importanti nella tecnologia Ni-NTA sono:

il legame tra ione metallico e proteina è reversibile: ciò è essenziale per poter poi distaccare

• le proteine al termine della purificazione

il pH deve essere basico: a pH basico le istidine sono deprotonate e possono formare un

• legame con lo ione metallico

La tecnologia Ni-NTA è quella più utilizzata in generale per la purificazione di proteine.

Come funziona tale tecnologia Ni-NTA?

FS è una matrice di gel di agarosio che lega una molecola di NTA.

L'NTA termina con il gruppo chelante che chela un atomo di nichel.

Il Nichel forma 4 legami di coordinazione con l'NTA e altri due legami con due atomi di N di due

residui di istidina contigui (Hys deprotonate).

La cromatografia Ni-NTA è condotta a pH basico perché è necessario che gli atomi di N associati

alla proteina da purificare siano deprotonati in modo da formare i legami di coniugazione con il

nichel.

Dopo che la proteina di interesse si è legata selettivamente alla FS, essa deve essere eluita ovvero

allontanata dalla FS che l'ha immobilizzata.

E’ possibile eluire la proteina dalla resina in due modi:

con concentrazioni crescenti di imidazolo (analogo strutturale delle istidine): si aggiunge

• un eccesso di imidazolo.

L'imidazolo possiede lo stesso anello imidazolico identificabile nelle istidine; esso compete

con queste per il legame alla resina.

Si utilizzano concentrazioni crescenti perché, almeno inizialmente, non si conosce l'esatta

concentrazione di imidazolo con cui è possibile distaccare le proteine

con tamponi di eluizione con valori di pH decrescenti, in modo da protonare i gruppi

• imidazolici delle istidine legati alla resina.

Acidificando il tampone della FM, si favorisce la protonazione dei