Appunti Biochimica applicata

TECNOLOGIA LEGATA ALLA PROTEOMICA

Le tecniche fino ad ora considerate (cromatografie) NON sono applicabili per l'analisi del

proteoma.

Infatti è necessario separare in modo più specifico le proteine presenti nel lisato proteico totale (di

una certa cellula in un dato momento).

Le tecnologie che vengono utilizzate per l'analisi del proteoma sono le seguenti:

Elettroforesi bidimensionale: è la parte biochimica dell'analisi del proteoma.

• Permette di isolare, tra le migliaia di proteine, la singola proteina di interesse

Rilevazione degli “spot” proteici: le proteine sono rilevate come spot nel gel bidimensionale

• Analisi di immagine

• Excisione degli “spot” proteici: gli spot sono tagliati dal gel

• Digestione enzimatica: gli spot sono digeriti

• Spettrometria di massa: è un'analisi molto complicata che richiede competenze specifiche

• Bioinformatica: l'analisi bioinformatica permette di conoscere l'identità della proteina di

• interesse

Quindi l'analisi del proteoma richiede conoscenze sia biochimiche sia bioinformatiche.

La proteomica mira a riempire il gap tra la sequenza genomica e la fisiologia della cellula e a

studiare la dinamica dei prodotti genici e delle loro interazioni attraverso l’integrazione di diversi

approcci analitici.

Le principali tecniche (approcci analitici) che vengono utilizzati sono:

Elettroforesi bi-dimensionale

• Spettrometria di massa

•

Per comprendere il proteoma (e quindi capire come questo varia nel tempo e nei vari soggetti) è

necessario ricercare, caratterizzare e catalogare le proteine.

Per arrivare ad identificare e caratterizzare una (nuova) proteina sono necessari molti passi/step

successivi (importante):

1. separazione delle proteine mediante elettroforesi bidimensionale

2. frammentazione in peptidi delle proteine isolate

3. analisi dei peptidi tramite spettrometria di massa

L'analisi del proteoma viene condotta quando (IMPORTANTE):

Desidero identificare una proteina i cui livelli di espressione variano in una determinata

• condizione patologica scoprire quantificare studiare: la scoperta di nuove proteine è uno

degli obiettivi principali dell'analisi del proteoma

Desidero valutare se i livelli di espressione di una proteina tessuto specifica variano in

• una determinata condizione patologica: l'analisi del proteoma permette di quantificare i

livelli di proteina che è coinvolta in un determinato processo patologico

Desidero caratterizzare una proteina tessuto-specifica codificata da un gene di cui sono

• note mutazioni che causano disfunzioni a carico del tessuto in cui si esprime: la

caratterizzazione della proteina è essenziale per poterne comprendere la funzione

Quindi l'analisi del proteoma viene effettuata quando desidero scoprire, quantificare e studiare.

OTTENIMENTO DELLE PROTEINE

In che modo è possibile estrarre le proteine sulle quali vengono condotte le analisi?

Come si conduce un'analisi proteomica?

Immaginiamo di avere un paziente affetto da una patologia muscolare.

Inizialmente viene condotta una biopsia ovvero si effettua un prelievo del tessuto esprimente la

stessa (es muscolo) da un individuo sano e da uno malato.

Il controllo deve avere la stessa età e lo stesso sesso del malato in modo da poter ottenere un reale

confronto.

Successivamente si procede con la marcatura metabolica con radioattività cioè alle cellule (es

muscolari) in coltura viene fornito un amminoacido marcato radioattivamente in modo che tale aa

venga incorporato nelle proteine delle cellule.

Questo è importante per visualizzare le proteine; infatti per poter visualizzare le proteine è

necessario avere a disposizione uno strumento che consenta di vederle (normalmente le proteine

non si vedono).

Si ottengono quindi proteine radioattive; le proteine radioattive possono essere seguite (mediante

lastra autoradiografica).

Poi si prepara il campione ovvero si allestiscono delle colture di cellule (es muscoli) che vengono

ottenute da tessuti malati e sani.

Si procede quindi con la preparazione delle proteine totali ovvero attraverso appositi metodi si

estraggono le proteine dalle cellule (si ottengono lisati totali).

I metodi utilizzabili per l'estrazione del contenuto cellulare sono differenti.

Tutte le proteine (non solo quelle solubili ma anche quelle di membrana insolubili) vengono

ottenute mediante questa tecnica; esse vanno a costituire l'estratto proteico totale.

Infine si procede con la separazione delle diverse proteine e con l'analisi delle stesse.

ELETTROFORESI MONO-DIMENSIONALI

Si distinguono 3 tipologie di elettroforesi mono-dimensionali:

page: separazione in base alla carica e in base alle dimensioni.

• E' un'elettroforesi condotta in condizioni native

SDS-page: essa prevede la separazione delle proteine in base alle dimensioni.

• Infatti, essa utilizza l'SDS che è un detergente anionico che conferisce alle proteine la stessa

carica negativa; in queste condizioni, quindi, le proteine si separano solo in base al loro PM

poiché possiedono la medesima carica negativa.

E' un'elettroforesi condotta in condizioni denaturante

isoelettrofocalizzazione (IEF): le proteine sono separate solo in base alla loro carica e

• quindi in base al loro punto isoelettrico.

La IEF, quindi, è una tecnica che permette di separare molecole in funzione del loro diverso

punto isoelettrico.

Il procedimento viene in genere eseguito in gel formati in tubi sottili, all’interno dei quali

viene stabilito un gradiente di pH aggiungendo anfoliti, molecole con molte cariche + e – e

vari valori di PI.

(il pH acido si trova sulla parte alta del gel, il pH basico si trova sulla parte bassa)

In effetti, in questa tecnica, il gel di policrilammide viene inserito in piccoli tubi (tubini);

all'interno di questo gel si separano gli anfoliti.

Ciascun anfolita possiede un proprio pI; se si applica una corrente (campo elettrico), gli

anfoliti si separano in base al loro pI, creando in questo modo un gradiente di pH all'interno

del tubo.

Una volta che una proteina raggiunge la posizione in cui il pH corrisponde al suo pI, allora

essa NON migra più (poiché non è più carica).

Le proteine, quindi, caricate nel tubo si muovono fino a quando trovano il valore di pH del

gel che corrisponde al loro pI; poi si fermano.

L'isoelettrofocalizzazione possiede diverse applicazioni:

1. è utile per determinare il PI delle proteine: in questo caso si fa correre sul gel una miscela

di proteine con PI noto.

Tale tecnica è quindi importante per determinare il pI reale della proteina (si ricordi che ci

sono programmi che sulla base della sequenza aa della proteina permettono di definire un pI

teorico)

2. è una tecnica analitica molto sensibile e può essere usata per rivelare piccoli cambiamenti

nelle proteine, come modificazioni covalenti o proteolisi limitata: in effetti, modifiche post-

traduzionali (covalenti quali fosforilazioni, aggiunta di grassi ecc) possono modificare il pI

delle proteine

3. è particolarmente utile per separare isoenzimi, differenti forme molecolari dello stesso

enzima che differiscono fra di loro per pochi aminoacidi

4. in combinazione con la SDS-PAGE ha consentito l’identificazione di numerose proteine: è

l'applicazione più importante dell'isoelettrofocalizzazione.

Essa fa parte dell'analisi bidimensionale delle proteine

Ricorda!

In condizioni native (normali) le proteine si separano in base sia alla loro carica sia in base al loro

PM.

In condizioni denaturanti, invece, tutte le proteine sono caratterizzate dalla medesima carica

negativa (infatti si utilizza l'SDS che è un detergente anionico che conferisce alle proteine la stessa

carica). In queste condizioni, quindi, le proteine si separano solo in base al loro PM.

ELETTROFORESI BI-DIMENSIONALE

L'elettroforesi bidimensionale combina le caratteristiche della IEF (separazione in base al pI) a

quelle della SDS-PAGE (separazione in base alle dimensioni).

Le due tecniche, combinate insieme nell’elettroforesi su gel bi-dimensionale, permettono di

disporre del metodo analitico più sofisticato per la separazione di una miscela complessa di

proteine.

Il potere di risoluzione delle due tecniche combinate insieme è estremamente più elevato rispetto a

quello delle due tecniche applicate singolarmente.

E’ infatti molto improbabile che due proteine abbiano sia lo stesso peso molecolare (migrerebbero

come un’unica banda in SDS-PAGE) sia lo stesso punto isoelettrico (migrerebbero insieme in IEF).

Le proteine vengono separate secondo il loro PI nella prima dimensione (IEF) e secondo la loro

massa molecolare nella seconda dimensione (SDS-PAGE).

Quindi si prende il gel in cui è stata condotta l'IEF; successivamente si applica su questo gel una

SDS-PAGE.

Le proteine appaiono come spot neri (perché sono marcate radioattivamente).

L'utilizzo di questa tecnica bidimensionale permette di discriminare proteine che hanno lo stesso

PM o lo stesso pI e che quindi non vengono separate mediante un'elettroforesi monodimensionale.

PREPARAZIONE DEL CAMPIONE PROTEICO

Un’efficace procedura di preparazione del campione deve includere:

Solubilizzazione riproducibile di tutte le classi proteiche, incluse quelle idrofobiche: le

• proteine da analizzare sono tutte le proteine presenti a livello delle cellule.

Quindi devono essere analizzate non solo le proteine presenti nel citosol ma anche quelle

presenti a livello delle membrane.

Anche le proteine espresse a livello delle membrane devono essere, quindi, estratte e

solubilizzate.

Cioè, devono essere solubilizzate tutte le proteine presenti all'interno delle cellule

Prevenzione dell’aggregazione proteica e mantenimento della solubilità durante IEF: è

• necessario che le proteine vengano mantenute in soluzione per tutta la durata dell'IEF

Prevenzione di modificazioni chimiche ed enzimatiche dovute al processo di estrazione: le

• proteine devono essere integre e intatte nella fase di estrazione delle proteine.

Quindi si deve lavorare con inibitori delle proteasi, a 4 gradi ecc

La rimozione di macromolecole che possono interferire con il processo di IEF: nel

• tampone di lisi si identifica NaCl che viene richiesto per mantenere le proteine in soluzione.

L'NaCl è un sale quindi esso può disturbare la migrazione delle proteine nel rpocesso di IEF;

tale sale deve essere quindi rimosso per garantire la loro separazione.

Il NaCl viene però richiesto per poter mantenere le proteine solubili quindi questo

costituisce un problema.

Inoltre, le proteine al loro pI tendono ad essere meno solubili

Le proteine devono esse