Appunti Batteriologia

RESISTENZA GLI ANTIBIOTICI:

Grazie al biofilm, alcuni antibiotici, entrano a fatica. Infatti vantaggio del biofilm è

quello di protezione al batterio.

All’interno del biofilm troviamo una popolazione eterogenea con caratteristiche

fisiologiche particolari e diverse le une dalle altre. Ci sono alcune cellule batteriche,

che prendono il nome di “cellule persisters”, che si trovano in uno stato di

quiescenza (quindi non si replicano e non hanno un metabolismo attivo).

In alcuni casi, queste cellule di possono riattivare, tipo…

Queste particolari cellule del biofilm sono importanti per la tolleranza agli

antibiotici, essendo che anche le difese immunitarie non possono attaccarle.

Gli antibiotici, come le difese immunitarie, funzionano legandosi a un certo target

che si trova sulla cellula e ne regolano il suo stato fisiologico. Nel senso che disattiva

il suo metabolismo portando la cellula a morte. Se la cellula, come le persisters, è di

suo già disattivata, gli

antibiotici si legano a

essa ma non fanno niente

alla cellula.

Grazie al trattamento

antibiotico riesco ad

uccidere le cellule

batteriche, quindi il

numero di batteri (carica batterica) si abbassa, anche se rimangono quelle

quiescenti, quindi non si eliminano del tutto.

Le persisters, come detto, si possono riattivare. Infatti queste cellule sono le

principali cause del perché le infezioni da biofilm sono persistenti e tendono a

cronicizzare. Anche non eradicabili farmacologicamente.

STRATEGIE ANTI-BIOFILM (campo biomedico)

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Per guarire da una infezione da biofilm, se data da un device artificiale, è

innanzitutto necessario rimuovere il device che l’ha causata. Quindi eliminare la

fonte delle cellule persisters. Le strategie:

1. Disgregare la matrice del biofilm, tramite ad esempio radioterapie. Per casi

superficiali può essere efficace ma in casi più profondi non funziona.

2. Creare in laboratorio delle molecole per disgregare le cellule batteriche, non

formando più quindi il biofilm.

3. Inibire in principio la formazione di biofilm, lavorando magari sul materiale dei

device che inserisco all’interno del paziente. Materiali fatti in modo in cui non è

possibile l’adesione dei batteri.

4. Molecole che inibiscono il QS, quindi agire limitando la produzione di biofilm.

5. Rimuovere le persisters, non attaccabili da terapia fagica.

6. Usare fonti luminose (tipo nanoparticelle) che possono penetrare nel biofilm,

uccidendo i batteri tramite certe lunghezze d’onda. Questa tecnica è stata

provata da degli ingegneri ricercatori con microbiologi, ma contiene difficoltà

siccome la luce non è ancora abbastanza da eliminare tutti i batteri + i macrofagi

attuano azioni di fagocitosi anche contro queste particelle luminose.

7. Una soluzione sarebbe quella di riattivare le persisters ma non è facile siccome

hanno un sistema raffinato di vie metaboliche

La crescita batterica

I batteri si moltiplicano tramite scissione binaria con duplicazione del cromosoma

secondo un modello semiconservativo. La cellula aumenta di dimensioni, creando

poi un setto, nel quale di divideranno le due cellule formanti. In alcuni casi (tipo

negli stafilococchi o negli streptococchi) si ha un ritardo nel distacco della matrice,

quindi vengono fuori forme ”attaccate dalla matrice” anche se sono due cellule

completamente separate.

Il tempo di generazione è il tempo che una cellula batterica impiega per dividersi.

E. Coli ci mette circa 20 minuti

Mycobacterium Tuberculosis ci mette circa 360 minuti

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—> questo perché queste specie

batteriche hanno uno strato ceroso

esterno che ci mette tanto a formarsi. È

uno strato impermeabile che rende

difficile il passaggio di molte sostanze.

Vantaggioso nella resistenza ai

disinfettanti, antibiotici ecc. ma

svantaggioso perché anche i nutrienti

non riescono a passare facilmente.

Per studiare in laboratorio i

microrganismi dovrei avere una biomassa ottimale. Per arrivare a ciò io posso

coltivare i microrganismi; possono quindi studiarli ed identificarli per poi arrivare a

una strategia per eliminarli (quelli patogeni ovviamente).

Come li coltivo?

Coltivo i batteri tramite terreni di coltura che contengono il necessario (es macro e

micro nutrienti) per far cresce in un ambiente ottimale quel batterio che voglio

studiare.

Ricordiamo una nozione importante dei batteri, quella della curva di crescita:

1. Fase di latenza + poi fase di accelerazione. (I batteri si adattano al nuovo

ambiente dove sono inseriti)

2. Fase esponenziale + fase di decelerazione (il numero di batteri raddoppia in

maniera esponenziale)

3. Fase stazionaria (lo spazio e i nutrienti scarseggiano e si accumulano scarti. Il

numero di morte = al numero di replicazioni)

4. Fase di plateau (i batteri muoiono)

I terreni di coltura

Vengono suddivisi a seconda di alcune caratteristiche:

Resoconto accademico 42

1. STATO FISICO

1.1. Possiamo trovare terreni liquidi, che contengono sia nutrienti/tutto in fase

liquida. In un terreno liquido le cellule sono libere di muoversi e la quantità di batteri

all’interno della provetta è determinato dalla torbidità / assorbanza (= densità

ottica) , misurato con lo spettrofotometro. Ovviamente si possono avere dei residui/

sedimenti sul fondo della provetta. Quindi in un terreno liquido i batteri sono senza

limiti spaziali e possono usare questa caratteristica in laboratorio per far crescere i

batteri in modo continuo.

Tramite uno strumento chiamato “chemostato” nel quale all’interno viene coltivata

una coltura batterica in modo continuo (tasso di crescita costante) , mantenuta nella

fase esponenziale. Dentro c’è sempre terreno fresco. Viene poi inserito un elemento

limitante come interruttore (nel momento in cui lo tolgo non si replicano più).

Grazie allo spettrofotometro posso avere una stima delle cellule all’interno della

provetta, non distinguendo però tra cellule vive e morte e tra vari organismi.

“ tutto quello che produce torbidità viene calcolato “.

1.2. E terreni solidi, che ha sempre una componente che lo differenzia dal liquido

rendendolo di fatto solido, come ad esempio l’agar, anche se alcuni batteri si

nutrono di agar (infatti a volte capita di piastrare dei batteri in terreno solido e dopo

un po’ ritrovare il terreno liquido).

In questo terreno è possibile vedere come le colonie batteriche non sono libere di

muoversi , tranne una specie il proteus, infatti dove le metto sulla piastra queste

stanno. Questo aspetto è fondamentale in clinica perché riesco così a differenziare,

a seconda della morfologia della colonia - o anche dall’odore, le varie specie

batteriche/microbiche presenti.

Posso infatti capire se davanti ho una coltura pura (dove ho solo una specie

batterica), o mista (dove trovo due o più specie diverse). Grazie ai terreni solidi

possono inoltre subcoltivare da una coltura mista a una pura, cosa che non si può

fare con i terreni liquidi.

2. COMPOSIZIONE

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Suddivisi ancora in terreni minimi, dove conosco ogni singolo ingrediente e le

quantità utilizzate per preparare quel terreno, e terreni massimi/complessi, dove non

conoscono le quantità precise di tutti gli ingredienti.

3. FUNZIONE

Suddivisi a loro volta in:

3.1. Selettivi (favoriscono la crescita solo di un gruppo di organismi).

3.2. Non selettivi (fanno crescere tutti gli organismi indipendentemente dalla specie.

Viene frequentemente utilizzato in laboratorio).

3.3. Differenziali (differenziano le specie diverse che ci crescono, tramite quello che

vediamo sulla piastra).

Vediamo alcuni esempi di terreni

AGAR - sangue (spesso di montone o di cavallo).

È un terreno complesso, non selettivo e differenziale (capacità di fare emolisi =

capacità di rompere i globuli rossi).

Gli organismi vengono quindi suddivisi in tre categorie, in base a come si

comportano in questo terreno.

1. Beta-emolisi : distruggono completamente i globuli rossi. Conferiscono una

colorazione trasparente alle colonie che si formano sulla piastra.

Esempio: Pyogenes.

2. Alfa-emolisi: emolisi incompleta. Hanno enzimi che riescono a distruggere i

globuli rossi ma non del tutto. A livello visivo sulla piastra appare con un colorino

verdastro —> chiamati infatti “ viridianti “ .

Esempio: streptococchi viridanti.

3. Gamma-emolisi: completa assenza di enzimi che riescono a distruggere i globuli

rossi. La colonia cresce con il suo colore normale, poco visibile in piastra dato il

colore rosso scuro dell’agar sangue.

Esempio: enterococchi.

Come riconoscere di quale gruppo fa parte un batterio.

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Esempio: una faringo-tonsillite può essere causata da moltissimi organismi

patogeni. Come lo riconosco?

Uso un campione faringeo (per capirsi, i campioni che venivano prelevati ai tempi

del covid). In un paziente normale, piastrando, escono fuori tantissimi organismi

batterici, normale microbiota. Se piastrando vengono fuori altri organismi utilizzo

agar sangue per capire e ricercare il possibile patogeno.

AGAR - Sale Mannite

Terreno complesso, selettivo e differenziale.

Analizzando l’agar sale mannite vediamo che è un terreno molto salato. Ci sono 75

gr/mL di NaCl, quindi possiamo dedurre che in questo terreno crescano solo batteri

alofili (che crescono bene ad alte concentrazioni di soluti). Per questo motivo è

selettivo.

Lo zucchero presente negli ingredienti è il Mannitolo, utilizzabile solo da alcune

specie batteriche. Quando i batteri riescono a metabolizzare il mannitolo,

acidificano l’ambiente in cui si trovano. Essendo presente anche un indicatore di pH

(il rosso-fenolo), nel momento in cui mi trovo a coltivare una coltura di batteri che

metabolizzano questo zucchero, l’ambiente / il terreno cambierà di colore. Diventerà

di un giallino, al contrario del rosso, in situazioni in cui sono presenti batteri che non

riescono a metabolizzarlo. Per questo motivo è differenziale.

—> questo terreno permette quindi di distinguere gli stafilococchi

Es: staphilococcus epidermidis (mannitolo negativo), su piastra sono rossi;

staphilococcus aureus (mannitolo positivo), su piastra sono gialli.

MACCONKEY AGAR

Terreno complesso, selettivo e differenziale.

Questo terreno impedisce la crescita di batteri gram+ , se crescono organismi

piastrando un campione su questo terreno, saranno organismi gram-.

Lo zucchero inserito in questo terreno è il lattosio, quindi cresceranno i batteri che

lo possono fermentare.

Es: Escherichia Coli è un batterio gram - , lattosio positivo, quindi crescerà