Appunti Batteriologia

Microbiologia generale

Libri di testo

Dehò e Galli: Biologia dei microrganismi. Dal punto di vista iconografico ha schemi più semplici. Le slide sono presi da lì. Brock: Biologia dei microrganismi. Tratta più estesamente la parte di chimica delle fermentazioni. Né il Brock né il Dehò Galli trattano la virologia. Se si ha bisogno di un supporto serve elementi di virologia molecolare Cann. Password: MICRO_2017

Introduzione

Storia e scopo della microbiologia

Quando parliamo di organismo, parliamo di entità in grado di replicarsi in modo indipendente. Quindi rientrano in modo perfetto batteri, funghi e protozoi. Non entrano in modo stretto in questa classificazione i virus e gli elminti (e.g. tenia) perché non sono in grado di replicarsi senza un organismo ospite.

La microbiologia studia diversi aspetti; è la scienza che studia i microbi, organismi troppo piccoli per essere visti ad occhio nudo, e la loro attività. Studia la loro forma, struttura, riproduzione, fisiologia, metabolismo e identificazione. Comprende lo studio la distribuzione delle attività microbiche che interessano l’uomo: dei microbi in natura, relazioni effetti benefici e dannosi tra loro e con altri esseri viventi, delle modificazioni chimiche e fisiche che hanno sugli esseri umani, delle che provocano nel loro ambiente (microbiologia ambientale, medica, agraria, industriale, alimentare, veterinaria).

Cosa sono i microrganismi?

Batteri (procarioti), alcuni eucarioti microscopici (funghi o protozoi) e alcuni tipi di alghe. Sono normalmente unicellulari, di piccole dimensioni privi di organizzazione e visibili solo al microscopio. Ci sono anche microrganismi cellulari, parassiti intracellulari obbligati e che potrebbero essere considerati "non viventi" poiché mancano di organizzazione cellulare: i virus.

• Virus: Microrganismo parassita intracellulare obbligato costituito da proteine e un acido nucleico.
• Elminti
• Prioni: Proteine capaci di autoreplicarsi.

Eucarioti e procarioti: dimensioni

In genere le cellule eucariotiche sono più grandi di quelle procariotiche e quelle procariotiche dei virus. Ma non è sempre vero. E. coli è più grande per esempio di un globulo rosso. Inoltre, vi sono virus che raggiungono le dimensioni dei batteri più piccoli come il virus del vaiolo.

L'importanza dei microrganismi

Sono essenziali per la vita: fondamentali per l'equilibrio biologico sulla terra: per cicli geochimici e fertilizzazione del suolo; riciclano fattori nutritivi come S e P che possono essere usati dalle piante e dagli animali. Causa di malattie che colpiscono il regno vegetale e animale. Usati come modelli sperimentali per lo studio della genetica molecolare e fisiologia cellulare. Sono causa di degradazione degli alimenti e usati come biomassa e produttori di sostanze utili per l’uomo (farmaci, vaccini, vitamine ed altre molecole per uso industriale). Usati come vettori per il trasferimento ed espressione di transgeni (vaccini, terapia genica).

Dibattito sull'origine della vita

Generazione spontanea (abiogenesi) o Biogenesi. L’ipotesi che i microrganismi viventi derivino dalla materia inorganica è detta "generazione spontanea": una forza vitale avrebbe formato la vita. L’ipotesi alternativa ha come principio che i viventi derivino da una vita pre-esistente chiamata biogenesi.

Aristotele affermava che gli animali potessero originarsi spontaneamente da piante e dal terreno. Fino al XVII secolo si pensava che i microrganismi potessero generarsi spontaneamente dalla materia in decomposizione (abiogenesi). I microrganismi originano spontaneamente dalla materia inanimata, ma derivano da altri microrganismi (biogenesi).

Abiogenesi o biogenesi?

Redi dimostrò con un semplice esperimento l’assurdità dell’assunto secondo il quale le larve si sviluppano sulla carne in decomposizione (si riteneva che la carne esposta all’aria generasse larve di insetti). Risultati dell’esperimento: giare aperte → comparsa di larve, giare coperte con garza → nessuna larva. Da dove vengono le larve? In presenza della garza, nessun insetto poteva penetrare dentro la giara, dimostra così che le larve si sviluppano solo dove potevano arrivare le mosce: confutazione della teoria della generazione spontanea. Convinse per la biogenesi di insetti, non per microrganismi.

Leeuwenhoek era un commerciante di tessuti olandese con passione per lenti di ingrandimento. Fonda Royal Society. Fu il primo a descrivere i batteri. Inventa una specie di microscopio usando una sola lente e scopre gli animalcules e la loro abbondanza. Le ricerche portarono un intero mondo visibile alla consapevolezza degli scienziati dell’epoca. Si aprì un dibattito sull’origine degli animalcules, che si prolungò per due secoli, inserendosi nella polemica teoria della generazione spontanea, accettata senza discussione. Si formano spontaneamente da materia inorganica inerte o da semi o germi sempre presenti in aria e deposti da altri animalcules?

Esperimenti di Needham e Spallanzani

Needham rese noti i suoi risultati: sottopone a bollitura (sterilizzazione per riscaldamento, per uccidere tutte le forme di vita) per un breve periodo di tempo del brodo di montone contenuto in un matraccio di vetro (matraccio sempre aperto): con il tempo il brodo si intorbidisce (crescita microbica) → risultati a favore della generazione spontanea. La vita era prodotta da una "forza vitale" presente nell’aria e il calore la distruggeva.

Spallanzani dimostra che il brodo restava sterile solo se il recipiente veniva sigillato prima di essere sottoposto a bollitura: gli animalcules penetrano negli infusi tramite l’aria.

Priestly dimostra che l’ossigeno è indispensabile alla vita, i sostenitori della teoria abiotica obbiettarono che nelle fiasche sigillate da Spallanzani il calore doveva aver alterato l’ossigeno nel brodo impedendo lo sviluppo spontaneo dei microrganismi. Critica dei difensori della generazione spontanea: senza O₂ non si sviluppa la vita!

Esperimenti di Pasteur

Pasteur risolve la controversia sulla generazione spontanea dimostrando che i microrganismi sono presenti nell’aria: usa palloni a collo di cigno, così, anche se il recipiente non è sigillato, dopo il riscaldamento l’infuso rimane sterile. Esperimento: liquido sterilizzato per riscaldamento. Inserisco in un pallone il liquido, piego con la fiamma il collo creando delle pieghe, riscaldo il pallone sterilizzando il liquido. In questo modo l’aria poteva penetrare, ma la polvere no. Le pieghe del collo del matraccio impedivano alla polvere contenente i microbi di raggiungere il liquido, che rimane così sterile. Ciò dimostrava che la crescita era dovuta ad una contaminazione esterna.

Se la fiasca veniva inclinata, in seguito al contatto del liquido con polveri depositate si aveva crescita di microrganismi. Dimostra la presenza di microrganismi nell’aria.

Altri contributi di Pasteur

Scopre la fermentazione come processo biologico studiando il fenomeno della vinificazione per conto di Napoleone III: il ruolo dei microrganismi nella trasformazione della sostanza organica, ovvero i lieviti metabolizzano gli zuccheri dell'uva sviluppando alcol etilico (vino); i batteri che usano alcol e producono acido acetico deteriorano il vino trasformandolo in aceto. Con il processo di pasteurizzazione si arresta lo sviluppo di eventuali batteri contaminati dell’aria che potrebbero interferire con la fermentazione batterica: riscaldamento del vino in fermentazione a una determinata temperatura (63° per mezz’ora, non sufficientemente caldo da fare evaporare l’alcol nel vino).

Esperimenti di Tyndall

Ripete gli esperimenti di Pasteur, ma non ottiene gli stessi risultati con infusi da fieno secco. Non basta la bollitura per sterilizzare così riprendono forza i sostenitori della abiogenesi. Tyndall capisce che il fieno secco contiene spore (alcuni microrganismi sono sporigeni) che sono di gran lunga più resistenti al calore dei microrganismi con cui aveva condotto gli esperimenti fino ad allora. Processo di tindalizzazione: riscaldamento, più volte, alternativamente a 20-37° e 60-80° C: con la T inferiore si induce trasformazione di eventuali spore in forme vegetative e con riscaldamento queste vengono distrutte.

Scoperta del ruolo di microrganismi come agenti infettivi

Lister, chirurgo inglese, suggerisce la sterilizzazione degli strumenti chirurgici. Semmelweis e febbre puerperale: constatò che i decessi si triplicavano quando le puerpere venivano esaminate da studenti di medicina. Lavandosi le mani si preveniva la trasmissione della febbre puerperale da una paziente all’altra nei reparti di ostetricia.

Robert Koch ha dimostrato un ruolo causale (eziologico) tra una serie di microrganismi e una serie di malattie. Ha associato microbi a malattie particolari, la prima relazione trovata è stata tra Bacillus anthracis e il Carbonchio (l’antrace: generalmente si manifesta come malattia endemica in animali erbivori selvatici o domestici, come pecore, cavalli, capre e suini, ma può anche svilupparsi nell’uomo per esposizione ad animali infetti, inalazione di spore o ingestione di cibo contaminato da queste).

Postulati di Koch

• L’agente causale dev’essere presente in tutti i casi della malattia di cui sembra essere responsabile e dev’essere assente negli individui sani.
• Il microbo o agente causale dev’essere isolato dall’individuo affetto e, dopo essere stato messo in coltura, deve originare una sola specie ovvero una popolazione cellulare omogena: una coltura pura.
• Se inoculo la coltura pura in individui sani, questi devono sviluppare la malattia di cui si ritiene sia responsabile l’agente causale: relazione causa-effetto.
• Una volta infettati devo ritrovare l’agente causale e si deve poter isolare nuovamente. L’agente dev’essere re-isolato dall’individuo infettato sperimentalmente.

Alcuni agenti patogeni famosi non riescono a dimostrare tali postulati perché il microbo non è isolabile, oppure perché non posso rispondere al terzo, ovvero non posso inocularlo in un individuo sano, come il virus HIV, causa eziologica dell’AIDS.

I "postulati" di Koch molecolari:

• Non associano l’agente patogeno alla malattia, ma un gene alla patogenicità o alla virulenza. Il gene di un batterio o virus, associato alla patogenicità o virulenza deve trovarsi in tutti i ceppi patogeni di una certa specie ed assente nelle specie non patogene. Esempio: il vibrione che causa il colera, porta allo sviluppo della malattia solo se codifica una tossina, l’unica proteina responsabile dei sintomi; se tolgo quel gene, il vibrione diventa apatogeno.
• L’inattivazione selettiva del gene deve portare a una diminuzione misurabile della patogenicità o virulenza.
• Se reverto o complemento la mutazione, il patogeno deve tornare attivo e deve riuscire a infettare. Lo stesso vale se introduco quel gene in un ceppo non patogeno, il quale viene trasformato in patogeno. Il virus dell’influenza ha all’interno delle sue proteine una decina di residui basici e, se li elimino, il virus diventa molto meno virulento.

Batteriologia – Classificazione dei batteri

Tassonomia: classificazione, nomenclatura, identificazione. La classificazione prevede diverse categorie o livelli: specie, genere, famiglia, ordine, classe, phylum e DOMINIO (che sostituisce REGNO)

Domanda esame: nella classificazione dei batteri la specie rappresenta l’unità di base e all’interno individuo batteri con caratteristiche diverse, come E. coli. Quindi dentro una specie ci sono batteri che hanno comuni caratteri morfologici, colturali, biochimici, antigenici. Si parla di tassonomia dei batteri perché Darwin scriveva dell’origine della specie quindi è il motivo per cui per i batteri si fa questo tipo di ragionamento.

Secondo la tradizione esistono due tipi di classificazione:

• La classificazione filogenetica: stabilisce quali relazioni evolutive esistono tra gli organismi, fissa le linee della discendenza. Agevole per piante e animali, più difficile per i batteri.
• La classificazione fenetica: basata sul grado di reciproca somiglianza e dei caratteri fenotipici in comune. Più utile per i batteri, anche se non emerge la relazione evolutiva, ma si basa sulla relazione fenotipica e sulle somiglianze.

Tassonomia

• Classificazione: organizzazione degli organismi in gruppi.
• Nomenclatura: attribuzione di un nome al gruppo in conformità a regole scientifiche internazionali concordate.
• Identificazione: processo che permette di identificare un microrganismo (isolato in vitro) inserendolo in un gruppo con determinate caratteristiche e attribuendoli un nome.

Unità fondamentale della tassonomia: la specie. Come inserisco un batterio in una specie batterica? La specie batterica è l’unità base della classificazione. L’unità base, o specie, è definita da:

• Caratteristiche morfologiche: se si muove, se ha più flagelli e come sono distribuiti, come reagisce a colorazione (di gram), come cresce. Quindi dimensioni, modalità di movimento, reazioni alle colorazioni e crescita macroscopica.
• Caratteristiche biochimiche e nutrizionali, quindi tramite la formazione di determinati prodotti finali e altre informazioni biochimiche sui componenti cellulari e sui metaboliti.
• Valuto caratteristiche ecologiche.
• Valuto composizione in basi del DNA, la frequenza di determinate sequenze geniche, contenuto genomico: omologia e caratteristiche genetiche.

Denominata da un binomio in latino: genere (corsivo, maiuscolo: Escherichia) + specie in latino (minuscolo, corsivo: coli).

All’interno della specie: CEPPO. Il ceppo è una coltura pura derivante da una colonia batterica. Se prendo una colonia e la trasferisco in un altro terreno ottengo una colonia pura amplificata, che costituisce un ceppo. Ha tutte le caratteristiche tipiche dello S. aureus ma con piccole differenze. Dentro la specie si identificano i ceppi tipo: ceppo di riferimento per la classificazione, rappresentante una specie, detto "ceppo standard" o collezione. A questo si confrontano i nuovi isolati per la loro classificazione.

Si parla anche di biotipo (BIOVAR), germovar, morfovar, serovar, fagovar basandosi su differenze biochimiche, fisiologiche, genetiche, morfologiche, sierologiche e di suscettibilità ai fagi.

Classificazione fenetica

La classificazione dei batteri è essenzialmente fenetica, perché a livello di phyla, guarda caratteristiche morfologiche e fenotipiche, infatti la classificazione di riferimento è quella che divide i batteri in 4 divisioni, in base alle caratteristiche strutturali della parete cellulare. Il "metodo classificativo fenetico" è riportato nel Manuale del Bergey e suddivide i batteri in 4 DIVISIONI, a seconda della loro PARETE cellulare. Le sue caratteristiche strutturali sono fondamentali, infatti vengono usate come criterio per classificare i batteri.

• Gracilicutes: batteri con parete non molto spessa di tipo gram negativo, alcuni di questi sono virus, parassiti intracellulari obbligati.
• Firmicutes: sono batteri con parete cellulare tipica dei batteri di tipo gram positivo, divisi in: Firmibacteria (tra questi ci sono i cocchi e i bacilli patogeni per l’uomo) e Thallobacteria (ricordano i funghi e muffe, batteri con tendenza alla ramificazione, vengono più usati nei fermentatori per applicazioni industriali).
• Tenericutes: batteri privi di parete rigida, per esempio i micoplasmi.
• Mendosicutes: con parete anomala, rientrano tutti gli archeobatteri che hanno una parete particolare. Gli archeobatteri hanno caratteristiche comuni ai batteri e agli eucarioti.

Ulteriori suddivisioni in sezioni in base a:

• Proprietà tintoriali: diverse colorazioni a cui reagiscono in maniera diversa.
• Formazione di spore (batteri sporigeni).
• Richiesta di ossigeno.
• Profilo metabolico.

Tassonomia numerica

Il difetto principale della classificazione numerica è che è basata su caratteri fenotipici che nei batteri NON NECESSARIAMENTE corrispondono ad un’evoluzione comune. Non sono come gli alberi genealogici degli eucarioti, perché quelli dei batteri sono basati su caratteristiche fenotipiche che non necessariamente corrispondono all’evoluzione delle specie. Serve per valutare la somiglianza tra microrganismi. Vengono analizzati e valutati un gran numero di caratteri comparandoli tra loro (caratteristiche morfologiche, biochimiche e sierologiche): tutti i caratteri scelti hanno lo stesso valore. Si valuta quali caratteristiche sono presenti o meno nei microrganismi messi a confronto. Si calcola il coefficiente di similitudine, espresso come percentuale di tutte le caratteristiche considerate comuni ad entrambi i microrganismi. Da 0 (nessun carattere in comune) a 1 (tutti i caratteri in comune).

Attraverso questi coefficienti possiamo disegnare dendrogrammi. Esistono diversi modi per classificare i batteri. Quello di riferimento è il fenetico, che mostra notevoli discordanze rispetto alle relazioni filogenetiche, ma con grande importanza pratica.

Tassonomia microbica

È impossibile classificare i batteri in base alle relazioni filogenetiche. Un metodo valido class