Analisi dei medicinali

(NIST).

Esempi:

Esano:

● PM = 86

●

+

Ione molecolare M⬝ = 86 rappresenta il valore del composto intatto (tolto solo

●

l’elettrone)

Picco base = 57

● +

Vediamo anche l’MH piccolo che quasi visibili

●

Mentolo:

● PM = 156

● Picco più alto = 138

● Ione molecolare non si vede perché troppo instabile,

● (156 - 138 = 18) tale numero è il PM dell’acqua che viene persa a seguito della reazione:

●

La rottura è influenzata dall’intensità di legame e la stabilità del prodotto che si forma, tanto più

stabile e tanto più il picco sarà intenso, quindi più probabile che esista la molecola.

Cocaina: spettrometro di massa molto caratteristico

●

Ionizzazione chimica

Si usa quando le specie da analizzare sono troppo instabili o quando abbiamo la necessità di

osservare la specie che abbia un valore più vicino possibile alla mia specie ione molecolare.

Si utilizza una sostanza che faccia da tramite per la ionizzazione, quindi posso ionizzare un

composto (agente protonante) che indico come acido, ossia che funge nelle condizioni di

ionizzazione da acido e che sarà donatore di H+ o di un gruppo, che sommandosi alla sostanza,

creerà una specie nuova.

La ionizzazione chimica si opera con la stessa sorgente di quella di ionizzazione elettronica, la

differenza sta che in quella chimica si fa entrare, prima e durante l’arrivo del mio analita, anche

il gas di ionizzazione. Statisticamente il fascio di elettroni ionizza il gas e la specie carica del gas

funge da ionizzatore chimico sull’analita. Quindi il gas entra, il flusso di elettroni va in direzione

+

e strappa gli elettroni alla mia molecola e crea l’M⬝ , si ha in geometria ortogonale al flusso di

elettroni, ossia la molla che fa partire gli ioni verso l’analizzatore. Per farlo utilizza l’elettrodo

repulsore che viene caricato con la stessa carica dello ione che ho generato (+), collegato c’è un

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elettrodo a forma di anello, che ha carica opposta (-), e quindi le specie ioniche vengono spinte

in avanti dall’elettrodo del segno opposto e attratte dall’elettrodo ad anello che, essendo

bucato, passano in mezzo e poi vengono convogliati nell'analizzatore da un altro elettrodo che

accelera gli ioni, per poi arrivare al detector.

Le 2 tecniche sono complementari +

Ionizzazione classica genera M⬝ : riconosco la molecola sulla base dei suoi frammenti, dati

● dalla forte intensità di energia a cui è sottoposta, e studio la struttura della molecola. Lo

spettro a seguito di questa tecnica sarà

a righe multiple, la cui riga ad intensità

minore corrisponderà allo ione

molecolare

Ionizzazione chimica genera specie

● +

chimiche MH con PM simile a quello

della molecola di partenza. Quindi

osservo uno ione che non è molecolare

ma viene chiamato ione

pseudomolecolare,dato da una minore intensità di energia, ed essendo che non è più

radicale sarà molto più stabile e con un numero di frammenti molto più piccoli e meno

intensi, grazie a questo si può riconoscere la molecola senza osservare frammenti. Lo

spettro a seguito di questa tecnica avrà un numero minore di righe spettrali ma la specie

+

ionica più presente corrisponderà a MH

Strategie interpretative degli spettri

Picco base: picco più alto, quindi linea spettrale più intensa

● PM del C = 12,011 (lo 011 deriva dagli isotopi,

● perchè se prendo 1 mole di C naturale non

ho solo il C ma anche degli elementi più

pesanti)

PM del Cl = 36

● Isotopi del Cl che sono piuttosto presenti:

+

Cl 35 = M

● Cl 34 = M+2

● +

Gli isotopi del Cl si evidenziano nelle linee spettrali, quindi la visione di una linea M e una linea

M+2 di intensità circa metà è indicativa della presenza di un atomo di Cl nella molecola.

+

Nello spettro della molecola sopra l’M è indicato con 78, mentre M+2 con 80. In corrispondenza

ai valori di 63 e 65 troviamo la perdita di un gruppo metilico della molecola. Il 48 invece deriva

dalla frammentazione in cui ho perso il Cl poiché non c’è nessuna riga su 50.

Tali informazioni dati dallo spettro mi indica la struttura molecolare dei composti organici.

Regole della generazione delle linee spettrali

A. Prima si rompono i legami più deboli:

Legami singoli che riguardano gli eteroatomi

● 12

Legami singoli che riguardano gruppi funzionali elettronattratori ravvicinati (legami

● che si rompono facilmente sono quelli vicino al carbonile perchè è un legame un

po’ più polarizzato, quindi osservo una rottura omolitica attivata)

α

Altre rotture si hanno nelle molecole che possono formare ioni stabilizzati per risonanza

● Composti che contengono anelli aromatici formano specie ionica con m/z di 91 che è lo

● ione tropilio

B. Si hanno più specie ioniche che si formano sulla base della stabilità del prodotto che si

forma, quindi se rompo un legame ma si forma un prodotto estremamente instabile

questo avrà vita molto breve e quindi lo si osserverà poco.

Si formano specie ioniche favorite poiché sono stabilizzate (criteri di stabilizzazione)

● Presenza di doppi legami

● Gruppi aromatici

● Gruppi che possono delocalizzare la carica e i radicali

●

L’anello aromatico forma delle linee spettrali diverse rispetto all’anello alifatico

●

La spettrometria di massa è una tecnica con elevata potenza dal punto di vista analitico perché

è molto sensibile, selettiva e permette di avere sia informazioni qualitative (strutturale) sia

quantitative. Una delle strategie più vantaggiose della spettrometria di massa è quella di

accoppiarla a tecniche cromatografiche. Quindi la sostanza viene già portata in fase gassosa

dalla cromatografia, tramite tecnica del gas cromatografo, e al di fuori della colonna si attacca

lo spettrofotometro. Quindi risulterà che a ciascun cromatogramma sarà associata una misura

di massa che permetterà di avere un’indagine molto accurata anche in presenza di tante

sostanze. Tale meccanismo è fondamentale per lo studio delle interazioni dei farmaci con

l’organismo.

Approcci diversi della spettrometria di massa

Piccole molecole volatili: ionizzazione elettronica, ionizzazione chimica e gas

● cromatografo

Molecole polari: MALDI (per proteine e peptidi che vengono irradiate da un raggio ad alta

● intensità) e la Elettrospray

Elettrospray

Inietta nello spettrometro un liquido. Tale strumento è formato da:

Ago che funge da nebulizzatore (spray) che è diviso in 2 parti:

● 1. Parte centrale che convoglia il liquido con un foro molto sottile e quindi si ha la

formazione di gocce molto piccole

2. Parte esterna dove viene fatto flussare un gas di asciugatura che aiuta a:

Far sì che le goccioline siano il più piccole possibili

● Far evaporare il solvente dalle goccioline

●

L’ago determina la fuoriuscita delle goccioline, queste vengono caricate positivamente dal

capillare presente che ha una differenza di potenziale tra i 1000 e i 5000 V. Tale capillare crea un

campo elettrico molto elevato che fa sì che le cariche poggino sulla superficie delle gocce.

Tramite il gas riscaldante si ha che la dimensione delle gocce diminuisce e il solvente evapora,

questo fa sì che le cariche si avvicinino fino ad arrivare che la forza di repulsione diventi più 13

forte della tensione superficiale che tiene insieme le gocce causando l’esplosione di esse, ossia

l’esplosione coulombica. Questa esplosione genera la protonazione della molecola disciolta

+ +

nelle gocce formando ioni pseudomolecolari: [M+H] [M+Na]

+

Con questa tecnica non è possibile ottenere specie M∙ perché non viene utilizzata sufficiente

energia (si utilizza un’intensità di energia minore rispetto alla ionizzazione elettronica)

Questa tecnica si può accoppiare a tecniche di cromatografia liquida e, comparata alla

ionizzazione elettronica, è un processo con bassa resa (2%).

Fenomeno dell’elettrospray

L’applicazione della differenza di potenziale causa un deflusso

del liquido dandogli una forma conica (cono di Taylor). Pochi

millimetri dopo l’ago nel liquido compatto vengono sconvolte

le regole dell’equilibrio acido-base. Si ha che nell’espansione

del cono ci sono delle gocce relativamente grandi con una

certa dispersione di carica sulla loro superficie e mano a mano

che questa viene ridotta si ha come esito l’esplosione delle gocce con il trasferimento della

carica ai composti.

Al di fuori dello spray posso generare delle specie cariche positivamente e negativamente,

+ -

quest’ultima data dalla perdita di un H che va a formare ioni pseudomolecolari [M-H]

Spettro

Si osserverà un’unica riga spettrale che corrisponde alla specie protonata dello ione

pseudomolecolare, si tratta quindi di una tecnica soft usata per analizzare la molecola intatta

(analisi dei composti nella loro interezza).

APCI (ionizzazione chimica a pressione atmosferica)

Tale tecnica permette di analizzare le soluzioni liquide usando un solvente, quindi si va a

ionizzare uno dei componenti del solvente che farà da transfer per le altre molecole.

A differenza dell’elettrospary in cui genero specie multiple, qui genero solo specie

monocariche. Tale tecnica viene usata per sostanze troppo lipofiliche o che hanno un equilibrio

acido-base troppo debole che faticano ad essere ionizzate.

Si possono separare gli ioni secondo 2 metodiche: 14

Separazione di ioni nello spazio: posso creare un tipo di analizzatore in cui è presente un

● separatore con una determinata lunghezza che viene percorsa dagli ioni; accelerando gli

ioni tutti allo stesso modo e misurando il tempo che lo ione ci mette a percorrere quello

spazio (distanza come discriminante per dividere gli ioni).

Analizzatore a quadrupolo

Esso è formato da 4 elettrodi in acciaio di forma cilindrica a cui vengono applicate

radiofrequenze differenti e caricati in modo alternato. Gli ioni presenti nello spazio fra gli

elettrodi vengono alternativamente attratti a causa della variazione di corrente

determinando una traiettoria sinusoidale o a spirale, quindi ciascuno ione si muoverà con

una traiettoria differente. Se gli ho accelerati nello stesso modo:

A arriva prima

● B ci mette più tempo

●

Quindi risultano separati fisicamente nello spazio

Singolo quadrupolo EI

Faccio entrare la mia sostanza già in fase gassosa, ad esempio da un gas cromatografo, il