Analisi dei medicinali

Operazioni fondamentali

Agitazione

Favorisce la reazione fra sostanze in fasi diverse, per impedire la formazione di gradienti di concentrazione e di calore nel caso di miscele soggette a riscaldamento. Può essere operata manualmente con bacchettina di vetro o automaticamente con degli agitatori magnetici (sono spesso incorporati nella piastra);

Riscaldamento

• Piastra riscaldante, se il fondo del recipiente è piatto;
• Bagno ad olio (anche olio di vaselina), se il fondo del recipiente è tondo;
• Mantello riscaldante, di opportune dimensioni;
• Stufa per essiccazione, in presenza di un agente essiccante, può raggiungere temperature di 200-300°C;
• Muffola, una stufa per raggiungere temperature di 1800°C;
• Fiamma bunsen, per raggiungere temperature ancora superiori, dell’ordine di 1500°C, ove la fiamma abbia un ruolo ossidante o riducente nei confronti della sostanza;
• Riscaldamento a ricadere (o a riflusso), il concetto si basa sulla condensazione dei vapori prodotti dall’ebollizione. La condensazione è favorita dalla refrigerazione presente all’esterno del collo del pallone.

Essiccamento

Con l’aiuto di un agente essiccante (come, ad esempio, solfato di sodio anidro). L’agente essiccante deve avere la capacità di inglobare le molecole d’acqua, ci si accorge di possedere una soluzione secca (anidra) dal fatto che l’agente anidrificante non si agglomera e non si attacca alle pareti del recipiente, che si depositi sul fondo del recipiente e che la soluzione sia limpida. L’essiccamento può essere condotto anche con della silice, capace di assorbire piccole molecole di acqua (di solito il composto possiede anche un colorante che indica l’avvenuta anidrificazione), oppure con anidride fosforica P₂O₅ che si idrata ad acido fosforico.

Valutazione della solubilità

Da valutarsi in soluzione acquosa (acida, neutra o basica) o in solventi organici, in entrambi i casi a caldo e a freddo.

Tipologie di estrazione

Estrazione liquido-liquido (discontinua)

Consiste nel trasferimento di un soluto da un solvente A ad un solvente B, immiscibili tra loro. La ripartizione fra le due fasi è regolata dalla legge di ripartizione di Nernst. Nel caso in cui K=1, il soluto si ripartirà equamente fra le due fasi, perciò non sarà possibile estrarre selettivamente il soluto. Se K è elevato, non sarà possibile estrarre il soluto in un’unica operazione.

Quando K è elevato, l’estrazione può essere condotta grazie a un imbuto separatore. Questo va riempito per 2/3 e va agitato il contenuto con una mano sul tappo e l’altra sul rubinetto: durante l’agitazione è bene far uscire eventuali vapori del solvente (es.: CO₂) aprendo il rubinetto. Dopodiché, si sgocciola fino al livello di separazione fra le due fasi.

Il solvente utilizzato può essere più o meno denso dell’acqua e rispettivamente si stratificherà in basso o in alto. Se per esempio consideriamo un’estrazione con un solvente più pesante dell’acqua, nell’imbuto separatore il soluto si ripartirà secondo la legge di Nernst: si sgocciolerà fino a raggiungere la linea di separazione. Poi, si può fare un’altra estrazione aggiungendo altro solvente, per essere sicuri che tutto il soluto sciolto in acqua passi nel solvente. Il concetto inverso vale per i solventi più leggeri dell’acqua.

Può capitare che il solvente si mescoli parzialmente con l’acqua, formando un’emulsione. Quando si ha a che fare con le emulsioni, per risolverle basta lasciar riposare la miscela oppure lasciar ricadere più volte delicatamente l’imbuto sull’anello di sostegno. In alternativa, si può aggiungere del metanolo (per diminuire la solubilità di una fase nell’altra) oppure del brine (una soluzione satura di NaCl).

L’ultimo passaggio consiste nel ricavare il soluto disciolto nel solvente. Esiste uno strumento in grado di operare a pressione ridotta, chiamato rotavapor. Si tratta di un evaporatore rotante che lavora a basse temperature, in quanto la pressione ridotta grazie a una pompa da vuoto abbassa il punto di ebollizione del solvente, riuscendo a separarlo dal residuo non volatile. Il riscaldamento avviene grazie a un bagno ad acqua (intorno ai 40°C) all’interno del quale il pallone contenente la soluzione deve essere parzialmente immerso. L’efficienza di questo strumento è che lavora simile ad un apparecchio di distillazione: il solvente volatile che evapora viene fatto condensare (grazie all’acqua di refrigerazione) e convogliato in un pallone di raccolta; in questo modo è possibile ricavare anche il solvente.

Il Rotavapor del nostro laboratorio ha qualche differenza: il cilindro refrigerante possiede una deviazione che convoglia i vapori in un altro cilindro refrigerante e in un altro pallone di raccolta. In questo modo si evita che gli schizzi dei vapori condensati rientrino nel pallone principale. Può capitare che durante la separazione con l’imbuto possa passare un po’ di acqua nella nostra soluzione (magari perché non si chiude in tempo il rubinetto). Ciò implica che potrà esserci acqua nel residuo, che non evapora per le basse temperature. Per evitare ciò, conviene aggiungere preventivamente un agente anidrificante e poi filtrare. La scelta dell’agente anidrificante va fatta considerando che non deve reagire con il composto organico né fungere da catalizzatore; in più deve agire velocemente ed efficacemente, non deve essere solubile nel solvente organico e soprattutto deve essere economico. La filtrazione può poi essere effettuata con una carta da filtro a pieghe o con dell’ovatta.

Estrazione liquido-liquido (continua)

È l’estrazione più indicata quando K è molto basso. L’apparecchio chiamato in gergo “Perforatore” si basa sul riscaldamento e sulla condensazione del solvente, che gocciola in una soluzione acquosa del soluto in questione. Anche in questo caso, si distinguono solventi più o meno densi dell’acqua e sulla base della densità cambia la struttura dell’apparecchio.

Solvente più denso dell’acqua

Il solvente evapora e poi condensa nella parte alta del cilindro refrigerante. Nella parte bassa dello strumento è presente la soluzione acquosa della sostanza: gocciolando, il solvente trascina verso il basso le particelle di soluto. Quando il solvente arricchito supera un certo livello, viene nuovamente convogliato nel pallone del soluto puro.

Solvente meno denso dell’acqua

Il solvente evapora e poi condensa nella parte alta del cilindro refrigerante. Nella parte bassa dello strumento è presente la soluzione acquosa della sostanza: gocciolando, il solvente viene convogliato da un imbutino sul fondo dell’apparecchio e poi è lasciato libero di uscire nella soluzione acquosa. Risalirà a galla trascinando verso l’alto le particelle di soluto. Anche in questo caso, raggiunto un certo livello, il solvente arricchito sboccherà nel pallone del solvente puro.

Estrazione solido-liquido

SPE (Solid-Phase Extraction): Si basa sull’interazione fra l’interazione degli analiti da estrarre (disciolti in fase liquida o gassosa) con una fase solida adsorbente. Queste interazioni possono essere: di Van Der Waals (non polari), legami a idrogeno o forze dipolo-dipolo (polari) o di scambio ionico (ioniche) e hanno il compito di trattenere l’analita e permetterne in seguito l’eluizione con un solvente più affine all’analita di quanto non lo sia la fase solida. In questo modo è possibile separare l’analita di interesse da eventuali impurezze essendo sicuri che esso venga trattenuto dalla fase solida.

La fase adsorbente più impiegata è la silice (SiO₂) o allumina (Al₂O₃); negli ultimi anni stanno trovando impiego superiore anche i materiali ad accesso ristretto, che sono in grado di ritenere selettivamente un analita in base alle interazioni selettive e all’esclusione molecolare. Queste fasi adsorbenti sono spesso reperibili sotto forma di cartucce o colonnine: le cartucce hanno un corpo cilindrico in materiale plastico con un attacco luer femmina all’estremità superiore, per applicare una pressione positiva, e un attacco luer maschio all’estremità inferiore per collegare tra loro più cartucce o applicare il vuoto. Il materiale di impaccamento è tenuto in sede da due setti; la colonnina SPE è costituita da un corpo cilindrico simile a quello di una siringa senza pistone, con la fase adsorbente mantenuta in sede da due setti.

Nel caso in cui l’analita da estrarre si trovi in un solido, si opera in maniera diversa. Si procede alla frantumazione della fase solida e conseguentemente all’imbibizione con un solvente. La frantumazione rende più accessibile l’analita al solvente, che permea la fase solida riempiendo tutti gli spazi: i principi passano nel solvente secondo gradiente fino ad annullamento dello stesso, ovvero fino al raggiungimento dell’equilibrio. La migrazione è regolata dalla legge di Fick: D = coefficiente di diffusività (dipende dal sistema soluto-solvente e dalla temperatura) A = superficie di diffusione Δc/l = gradiente di concentrazione.

Dopodiché, basta filtrare il residuo. Mediante questo processo è possibile ricavare la caffeina dal caffè.

Metodo Soxhlet: Prevede l’utilizzo dell’omonimo apparecchio. Il solvente viene scaldato in un pallone, i vapori salgono lungo un tubo di bypass e condensano nella zona del refrigerante. Le gocce di solvente condensato vengono convogliate in un ditale di carta porosa contenente il solido da cui estrarre il principio. Il solvente arricchito fluisce all’esterno del ditale e quando supera una certa altezza nel sifone viene travasato nel pallone principale. È un metodo molto indicato per l’estrazione di principi da matrici vegetali. Nonostante sia un metodo molto semplice, non è adatto all’estrazione di sostanze termolabili, in più è un processo molto lungo e richiede grandi quantità di solvente.

Estrazione con fluidi supercritici (SCFs)

Un fluido è definito supercritico quando si trova in determinate condizioni di pressione e temperatura tali per cui la densità della fase liquida e della fase gassosa coincidono, ovvero al cosiddetto punto critico: in queste condizioni, non esiste alcuna separazione fra le due fasi. Le proprietà intermedie di un fluido supercritico sono utili, in quanto possiede la capacità solvente di un liquido ma capacità di trasporto di un gas.

In genere, i fluidi supercritici sono poco costosi, sono facilmente separabili dal solvente, sono poco tossici e sono in grado di estrarre analiti a temperature relativamente basse; tuttavia, gli impianti per la loro produzione sono molto costosi, servono apparecchiature costose per lavorarci e deve esserci un modo che consenta di ricomprimerli per poterli riutilizzare.

Un SCF poco costoso è la CO₂ supercritica. Le condizioni di temperatura e pressione del punto critico sono T = 37,7°C e P = 68 atm, per cui i modi per entrare in fase supercritica sono due: mantenere fissa la pressione e aumentare la temperatura, oppure mantenere fissa la temperatura e aumentare la pressione.

Le combinazioni temperatura-pressione ci consentono di regolare anche il potere solvatante del fluido, che dipende dalla densità. In particolare, dal grafico risulta evidente che se ci si attesta a temperature prossime a quella del punto critico (circa 40°C) e si aumenta la pressione, la densità aumenta più velocemente; tuttavia, gli incrementi sono più considerevoli per pressioni non tanto superiori a quella del punto critico (le curve tendono ad appiattirsi e gli incrementi di densità sono meno rilevanti).

La CO₂ supercritica, nonostante sia molto versatile, si comporta come una sostanza apolare (simile al N-esano) e quindi non è indicata per l’estrazione di composti solubili in acqua. Per migliorare l’efficienza estrattiva, basta aggiungere un composto come MeOH o EtOH, che aumenta la polarità del sistema. Si potrebbe utilizzare acqua supercritica, se non che la T = 374°C e la P = 220,5 bar, valori decisamente troppo alti.

I SCFs sono spesso impiegati per l’estrazione degli aromi dal luppolo o dell’estrazione della caffeina dal caffè.

Saggi fondamentali per analisi di incogniti

Calcinazione

Questo processo consiste nel riscaldare la sostanza da analizzare in una capsula di porcellana sulla fiamma del bunsen, traendo informazioni dalle trasformazioni visibili e osservando un ipotetico residuo al termine dell’operazione:

• Assenza di particelle carboniose: Potrebbe trattarsi di un composto di natura inorganica, che può tutt'al più fondere o sublimare.
• Presenza di particelle carboniose: Se è visibile la carbonizzazione, si nota un residuo o un’opalescenza nera. Il composto può essere di natura organica o metallorganica; nel caso in cui si tratti di un composto organico, per esposizione prolungata alla fiamma, tutto il carbone dovrebbe scomparire (il carbonio si ossida a CO₂); nel caso in cui si tratti di un composto metallorganico, esponendo il residuo nero opaco a fiamma riducente si forma localmente un alone che evidenzia la natura del composto metallico (es.: il lattato di calcio evidenzia un alone bianco).

Grazie alla calcinazione è possibile riconoscere preventivamente gli zuccheri, che fondono, anneriscono e possiedono un odore di zucchero bruciato caratteristico, oppure i sulfamidici, che anneriscono e rigonfiano. Inoltre, è possibile osservare il colore della fiamma (qualora siano presenti ioni inorganici che danno fiamme colorate) e di eventuali fumi (le sostanze organiche danno origine a fumi neri), o alcuni odori (es.: composti ammoniacali). Ovviamente queste caratteristiche possono essere osservate meglio in tubicino.

Saggio di Lassaigne

Si tratta di un saggio da effettuare qualora ci si trovi in presenza di una sostanza organica, per cui è necessaria una preventiva calcinazione. È un saggio in tubicino che consente di stabilire la presenza di azoto, solfo e/o alogeni. Si introduce una piccola quantità di sostanza in tubicino, aggiungendovi un pezzetto di sodio metallico, purché sia in eccesso. Dopodiché si scalda il tubicino in fiamma fino a calor rosso e in modo prolungato (più di 2 min), permettendo ai fumi di combustione di uscire dal tubicino stesso.

Infine si rompe il tubicino in un calice riempito con acqua deionizzata fredda, sfruttando lo shock termico, e si filtra con un filtro a pieghe. La soluzione ottenuta deve essere limpida e incolore; qualora essa non lo sia, vuol dire che la sostanza organica è stata degradata solo parzialmente e quindi il saggio va ripetuto scaldando la sostanza per più tempo.

A. Ricerca dell’azoto: La soluzione alcalina viene trattata con qualche cristallo di solfato di ferro (II). Se fosse presente zolfo, potrebbe formarsi un precipitato nero di solfuro di ferro. Si riscalda 1-2 minuti su piastra e si acidifica con H₂SO₄, per sciogliere il solfuro di ferro e gli idrossidi di ferro. In presenza di azoto, si osserva la formazione di un precipitato o di una colorazione azzurra-verde.

B. Ricerca dello zolfo: La soluzione alcalina viene acidificata con acido acetico diluito e vengono aggiunte alcune gocce di una soluzione di acetato di piombo all’1%: un precipitato nero di PbS indica la presenza di zolfo.

C. Ricerca degli alogeni:

• Quando azoto e zolfo sono risultati assenti: La soluzione alcalina viene acidificata con acido nitrico diluito e trattata con qualche goccia di una soluzione di nitrato d’argento. La formazione di un precipitato indica la presenza di alogeni.
  • AgCl bianco, solubile in NH₃ diluita o (NH₄)₂CO₃
  • AgBr giallo pallido, solubile in NH₃ concentrata
  • AgI giallo, insolubile anche in NH₃ concentrata
• La presenza di bromuri e ioduri può essere confermata con il saggio con l’acqua di cloro:
  • Bromuri: Acidificare con H₂SO₄ dil, aggiungere alcune gocce di acqua di cloro e 1 ml di cloroformio. Agitando, la fase organica (sottostante) si colora di arancio.
  • Ioduri: Acidificare con H₂SO₄ dil, aggiungere alcune gocce di acqua di cloro e 1 ml di cloroformio. Agitando, la fase organica (sottostante) si colora di viola.
• Quando azoto e/o zolfo sono risultati presenti:
  • Alla soluzione di Lassaigne si aggiunge un uguale volume di HNO₃ conc. Si riscalda in capsula fino a ridurre a metà il volume della soluzione, quindi si procede normalmente per la ricerca degli alogeni.
  • Alla soluzione di Lassaigne si aggiunge una pipettata di una soluzione di Zn(NO₃)₂. I precipitati vengono eliminati per centrifugazione, quindi si procede normalmente per la ricerca degli alogeni.
  • Saggio di Beilstein: Il filo di rame viene riscaldato alla fiamma fino a quando questa rimane incolore. Una volta raffreddato il filo, si fa aderire un po’ di sostanza incognita e si pone di nuovo sulla fiamma. In presenza di alogeni si osserva una fiamma di colore verde, dovuta alla formazione di alogenuri di rame volatili.

Nel caso in cui sia stata evidenziata la presenza di zolfo e/o alogeni, è necessario...