Analisi dei medicinali

R R

(mL/sec).

La velocità di flusso dipende dalle dimensioni della

colonna, caratteristiche fisiche delle particelle che

compongono la fase stazionaria e dalla viscosità

della fase mobile.

Colonne diverse possono quindi avere velocità di

flusso diverse, quindi si calcola il volume di ritenzione per poter effettuare un paragone tra

cromatogrammi diversi svolti però nelle stesse condizioni. 11

Fattore di capacità o fattore di

ritenzione (K’)

Parametro sperimentale usato per

descrivere le velocità di migrazione

del soluto, esso misura del tempo che

un determinato composto impiega ad

attraversare la colonna in rapporto al

tempo impiegato da un composto

non trattenuto. − '

' = =

t’ = tempo di ritenzione corretto

R

t = tempo morto

M

Nel caso di un composto non

trattenuto k’ è uguale a 0 e il fattore di

ritenzione è una misura della ritenzione da parte della fase stazionaria.

k’ dipende dalla quantità del soluto nelle 2 fasi, quindi poiché la quantità e la concentrazione

sono in relazione con il volume si può scrivere:

à ×

' = =

à ×

Possiamo quindi sostituire k nell’equazione del fattore di ritenzione:

= ' =

K dipende dalla natura del soluto

● V dipende da:

● S Temperatura (che ha un ruolo fondamentale nella cromatografia)

● Natura delle fasi

● Caratteristiche della colonna

● Fattore di separazione o selettività ( )

α

Se abbiamo 2 composti A e B caratterizzati da coefficienti di

distribuzione Ka e Kb e quindi di conseguenza abbiamo i

fattori di capacità k’a k’b possiamo definire il fattore di

separazione: ' (')

α = = =

' (')

Quindi affinchè ci sia una separazione Ka ≠ Kb e quindi ≠ 1.

α

La ritenzione relativa di due soluti è proporzionale al rapporto

dei loro coefficienti di ripartizione (fondamento fisico della

cromatografia).

Tanto più i fattori sono vicini e tanto più bassa è la selettività,

quindi affinché ci sia un’alta selettività è necessario che i

fattori siano sufficientemente distanti. 12

Effetto della selettività sulla separazione dei

picchi cromatografici

Quindi la differenza nei tempi di eluizione tra i

picchi indica la selettività e questa quantifica

la capacità di un sistema cromatografico di

eluire specie chimiche diverse in tempi

diversi.

Parametri che descrivono quantitativamente

l'efficienza di una colonna:

1. Altezza equivalente di piatto teorico H

2. Numero di piatti teorici N

Piatto teorico: zona della colonna dove si

● ha l’equilibrio di distribuzione dell’analita

tra FS e FM.

Poiché nella cromatografia si ha una sequenza continua di stati all’equilibrio e non vi è

possibilità di realizzare una singola separazione, N ha un significato solo matematico.

Numero di piatti teorici N e altezza del piatto teorico H

Conoscendo N di una colonna e la sua lunghezza si può calcolare H

=

Esempio:

Colonna da esclusione molecolare: Sephadex 75

● HiLoad

Larghezza: 16 mm

● Lunghezza: 600 mm

● N: 7800

● 0,6

H= = 0,0000769 = 76 m

● µ

7800

Più elevato è il numero di piatti teorici, più grande è la

probabilità di una separazione, migliore è l’efficienza della colonna

Effetto della efficienza sulla separazione dei

picchi cromatografici

La larghezza dei picchi indica l’efficienza, i

quali più sono larghi e peggiore è la loro

separazione 13

Risoluzione

Una buona risoluzione può derivare da:

Buona efficienza

● Buona selettività

●

A: Risoluzione scarsa per scarsa efficienza e selettività

B: buona risoluzione per buona efficienza e selettività

C: buona risoluzione per buona selettività ma efficienza

non troppo elevata

D: risoluzione scarsa per una bassa selettività

É possibile migliorare la risoluzione

migliorando uno qualsiasi di questi

parametri:

La selettività è il fattore che più

● influisce sulla risoluzione. Piccole

variazioni di selettività si traducono in

variazioni cospicue di risoluzione

La ritenzione è un fattore significativo a valori ridotti di k

● L’efficienza rappresenta la capacità di separazione della colonna

●

Per ottenere un’alta risoluzione con una determinata colonna è necessario massimizzare 3

termini:

Aumentare il numero di piatti teorici:

Aumentando la lunghezza della colonna

●

Ridurre l’altezza del piatto teorico:

Riducendo la dimensione delle particelle della fase stazionaria

●

Fattore di capacità:

Variando la composizione FS

●

Il modello dei piatti teorici serve a per comprendere le basi del processo di separazione ma

permette di avere un modello matematico che identifica le variabili per ottimizzarlo. 14

Tuttavia la teoria dei piatti trascura l’aspetto cinetico; la velocità del flusso della fase mobile

influisce sulla larghezza del picco. Per spiegare questa relazione si usa la teoria cinetica.

Ci sono 3 meccanismi responsabili della dispersione del soluto nella colonna (allargamento del

picco):

Diffusione vorticosa

● Diffusione Longitudinale

● Trasferimento di massa

●

L’equazione di van Deemter esprime l’influenza della colonna e della velocità del flusso

sull’altezza del piatto

Diffusione vorticosa

Diffusione assiale o longitudinale

Aumento nell’ampiezza del picco a causa di fenomeni di auto-diffusione dell’analita

● A bassi valori di flusso l’analita rimane nella fase mobile per un periodo prolungato

● Netto aumento nell’ampiezza del picco

● Incremento dell’altezza di un piatto teorico

●

Resistenza al trasferimento di massa

Esiste un tempo necessario perché il soluto raggiunga

l’equilibrio tra FM e FS. All’inizio le molecole di analita più

vicine alla FS diffondono dalla FM alla FS. Le molecole

rimaste nella fase mobile si spostano trascinate dalla

corrente dell’eluente e diffondono nella FS creando un

allargamento della banda. Lo stesso meccanismo di

diffusione asimmetrica si instaura per il procedimento

inverso (da FS a FM).

Questo processo dipende dalla diffusività del soluto dalla

FS alla FM e viceversa, diminuisce con il diminuire della

viscosità del solvente ed aumenta con l’aumentare della

velocità della FM. 15

L’efficienza dipende da variabili cinetiche:

Velocità della FM

● Dimensioni delle particelle della FS e suo impaccamento

● Diametro della colonna

●

Ottimizzazione delle prestazioni di una colonna:

FM: Natura del flusso

● Flusso

●

FS: Fattore di capacità K’

● Fattore di selettività

● α

Numero dei piatti teorici

● Altezza del piatto teorico

●

Tipologie di colonna cromatografica

Vetro

● Intermedie fatte di materiale plastico

● Liquida ad alta prestazione(HPLC): flusso ad alta pressione (anche 400 atm)

●

Scelta della FM

Si utilizza raramente un unico solvente infatti se ne utilizzano spesso più di uno e vengono

scelti (serie eluotropica) in base a diverse caratteristiche (per esempio se ho soluti lipofili)

Rilevatori cromatografici

Ottici: convertono la luce in segnale elettrico

● Ad assorbanza

● A fluorescenza

● A indice di rifrazione

●

Elettrochimici

● Spettrometria di massa

● Risonanza magnetica nucleare

●

Ad assorbanza

Spettrofotometro che indica quanto una molecola assorbe (analisi quantitativa con

l’applicazione della legge di Lambert-Beer), ma prima di questo dà informazioni qualitative

tramite dei picchi di assorbimento. Questi picchi indicano l’interazione dei gruppi funzionali

con la molecola, queste sono specifiche per ognuna ed analizzabili con una sola misura. I picchi

di assorbimento rientrano in una range dello spettro di assorbimento molecolare

dell’UV-visibile. 16

A fluorescenza

Questa tecnica è applicabile solo se la molecola fluoresce, che quindi la molecola stessa è

fluorescente o lo può diventare tramite reazione di derivatizzazione.

La spettrometria a fluorescenza è formata da 2 componenti:

Monocromatore di eccitazione

● Monocromatore di emissione

●

A indice di rifrazione

Confronta l’indice di rifrazione di un soluto rispetto alla FM, però non è una tecnica molto

selettiva

Elettrochimico

Componente che misura la conduttività

● Componente che misura l’intensità

●

Fasi di identificazione di una sostanza

1. Isolamento della sostanza da una miscela

2. Purificazione della sostanza

3. Esami preliminari

Esame organolettico

● Esame del comportamento alla calcinazione

● Ricerca dei carbonati, C, N, S, P e alogeni

● Solubilità

●

Solubilità

Quantità massima di sostanza che si può sciogliere in una quantità di solvente ad una certa

temperatura. =

Kps: prodotto di solubilità, ossia delle concentrazioni degli ioni provenienti dalla dissociazione

del composto in soluzione ed è un valore costante (per ogni valore di temperatura).

Più è alta la solubilità di una sostanza e più è solubile.

Affinché un soluto si sciolga in un solvente liquido occorre che le interazioni tra le molecole di

solvente e di soluto siano dello stesso tipo.

Soluti con elevata energia reticolare richiedono solventi con elevata costante dielettrica, molto

polari e capaci di formare legami H. Soluti con basse energie reticolari richiedono solventi

apolari o poco polari.

La maggior parte delle molecole organiche di interesse farmaceutico sono costituite da una

porzione polare (idrofila) e da una non polare (lipofila) per cui la solubilità dipende dal

contributo delle due porzioni.

Fattori che influenzano la solubilità

1. Proprietà chimico fisiche del solvente (variabile più importante): 17

Tipo e forza di legami impegna