Analisi biochimica degli alimenti (modulo 2)

DOT BLOT

Scopo: cercare se in campione è presente uno specifico antigene/proteina

Composizione:

• 3 strati di plastica che si possono assemblare uno sopra l'altro:
1. Piastra superiore con dei fori
2. Membrana viene posizionata tra due "piastre" forate
3. Piastra inferiore con dei fori - Fori piastra inferiore e superiore coincidono

Passaggi:

1. Dal campione alimentare estraggo proteine solubilizzandolo in un opportuno liquido
2. Campione in soluzione (= estratti proteici) deposti nei pozzetti superiori e inseriti nei fori - Fori associati a SISTEMA DI ASPIRAZIONE per creare il vuoto
3. Quando si attiva aspirazione del DOT BLOT il liquido passa attraverso membrana non impermeabile
• Liquido = passa sotto
• Proteina = si lega e si fissa sulla parte superiore della membrana
4. Piastra serve per depositare in modo preciso sulla membrana le proteine estratte da tanti campioni diversi - Ad ogni buco potrà corrispondere un diverso campione

Ottengo una membrana in cui in corrispondenza di ogni foro è presente proteina che apparteneva ad uncampione6) Smonto ed estraggo membrana7) Si deve avere a disposizione anticorpo specifico contro la determinata proteina→ serve per cercare se su quei campioni è presente la proteina12 Come se fosse un foglietto di carta, superficie piana ed estesa13 Polivinilidenfluoruro 23Fasi sulla membrana

1. BLOCCAGGIO/ SATURAZIONE della membrana
   1. Membrana viene messa a bagno in una soluzione contenente proteine inerti.Inerte = non reattiva/ non riconosciute dall’anticorpo→ Se mettessi direttamente gli anticorpi (cioè una proteina) in contatto con la membrana si andrebbe a legare lui stesso alla membrana poiché essendo una proteina verrebbe legato in modo aspecifico e non capirebbe nulla.
   2. Proteine inerti saturano tutta superficie della membrana non occupata in precedenza dalle proteine del campione.
2. ANTICORPO PRIMARIO specifico per l’antigene

1. Nella vaschetta, in cui è presente membrana bloccata, si aggiunge seconda soluzione contenente anticorpo specifico, anticorpo primario, per la proteina→ incubazione
2. Anticorpo primario
   • NON può più legarsi alla membrana poiché satura
   • Si lega all'antigene a sua volta fissato sulla membrana
3. Si forma complesso antigene-anticorpo fissato alla membrana
4. ANTICORPO SECONDARIO:
   1. Rimuovere eccesso di anticorpo primario mediante LAVAGGIO
   2. Aggiunta soluzione contenente anticorpo secondario→ incubazione
   3. Anticorpo secondario ha 2 caratteristiche
      • Specifico (riconosce come antigene) regione costante dell'anticorpo primario
      • Coniugato covalentemente ad un enzima (AP)
5. RILEVAZIONE del complesso antigene/anticorpo mediante una reazione cromatica
   1. Rimuovere eccesso di anticorpo secondario mediante LAVAGGIO
   2. Aggiunta SUBSTRATO→ Si immerge la membrana in una soluzione contenente substrato dell'enzima.

Enzima catalizza e trasforma substrato in prodotto. Si utilizzano substrati SOLUBILI che, in seguito alla catalisi enzimatica, formano prodotto insolubile colorato.

Prodotto colorato si accumula perché insolubile e precipita. Formazione precipitato colorato sulla membrana in corrispondenza della zona di deposizione di un campione, indica la presenza di antigene nel campione stesso (quindi dove era presente enzima). Se prodotto fosse solubile, si colorerebbe la soluzione di incubazione senza riuscire a identificare il/i campione/i contenente l'antigene.

Figura incompleta, immagina tutta la superficie ricoperta e non solo la parte sopra.

ELISA

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

- Test immuno-chimico quantitativo

- Complesso antigene-anticorpo legato ad un supporto plastico fatto di polistirene = PIASTRA / MICROPIASTRA

- Piastre hanno forme standard 8x12 = 96 pozzetti

- Passaggi

1. Ogni pozzetto (sopra aperti e sotto chiusi) contiene un campione

Campioni fisicamente sperati in ogni pozzetto3. Soluzioni aggiunte nei pozzetti→ Ogni soluzione agisce solo sul campione che gli compete4. Prodotto finale che si forma dalla reazione enzimatica è cromoforo solubileche colora tutta soluzione contenuta nel pozzetto.Essendo solubile si può misurare ASSORBANZA di ogni singola soluzione(nel DOT BLOT per forza insolubile per poter precipitare)− Test si presta ad essere automatizzato− ELISA distinti in base:o Caratteristica che le piastre di polistirene legano in modo aspecifico proteine▪ DIRETTO = Anticorpo legato al pozzetto (sandwich)▪ INDIRETTO = Antigene (proteina) legato al pozzettoo Modalità di conduzione▪ NON COMPETITIVO = Intensità di colore proporzionale alla presenza di analita▪ Diretto sandwich l’antigene deve essere in grado di legare 2 anticorpi.→ Non è sempre possibile, specialmente quando antigene è di piccole dimensioni▪ COMPETITIVO =

1. Antigene si lega all'anticorpo fissato nel pozzetto
2. Antigene si lega ad anticorpo che era legato alla piastra di polistirene= complesso ANTIGENE-ANTICORPO
3. Lavaggio: pozzetti vengono svuotati e lavati
4. Aggiunta soluzione contente anticorpo primario specifico per legarsi all'antigeneo
5. Anticorpo primario si lega all'antigeneo In eccesso perché deve legarsi a tutti gli antigeni presenti
6. Lavaggio: pozzetti lavati per rimuovere anticorpi primari in eccesso
7. Aggiunta soluzione contente anticorpo secondario
8. Due caratteristiche:
   1. Riconosce come antigene REGIONE COSTANTE dell'anticorpo primario
   2. Anticorpo secondario ha coniugato a sé stesso ENZIMA
   Aggiunto in eccesso e si legherà solo dove è presente il primario.
9. Lavaggio per rimuovere eccesso anticorpo secondario
10. In tutti i pozzetti si aggiunge una soluzione contente substrato per enzima→ Enzima trasforma substrato in prodotto colorato e solubile = Si colora tutta la soluzione

Casio ↑Tanto antigene = si legheranno anticorpo primario e secondario = Tanta quantità enzimao ↓Poco antigene = si legheranno anticorpo primario secondario = Bassa quantità enzima−

Nei diversi pozzetti è presenteo = concentrazione substratoo ≠ concentrazione di enzima (a seconda della quantità di antigene presente all’inizio)→ ≠formazione prodotto colorato procede con velocità ma tende allo stesso punto finale poichéconcertazione del substrato è identica in tutti i pozzetti−

Reazione cromatica va fermata prima del completamentoo Bloccaggio attraverso aggiunta di uno STOP della reazione(= acido che abbassa pH e l’enzima smette di catalizzare)o Bloccaggio in modo che quantità di colore formato sia dipendente dallaQUANTITÀ DI ENZIMA presente e quindi quanto antigene era presenteo Se non bloccassimo avremmo lo stesso identico colore in tutti i pozzetti.

.16 ELISA venduti in kit

I test commerciali contengono una piastra pronta all'uso, quindi non è richiesta una fase di preparazione della piastra.

26 - Assorbanza

Alcuni spettrofotometri possono leggere l'assorbanza delle singole soluzioni. Un raggio luminoso passa in ogni pozzetto dal basso verso l'alto e legge l'assorbanza.

Come trasformare l'assorbanza in quantità di analita?

• Non si può usare la legge di Lambert-Beer
• Si costruisce una retta di taratura

Retta di taratura:

La concentrazione dell'analita viene determinata per confronto con una retta di taratura.

Dei 96 pozzetti presenti, in alcuni vengono caricate quantità note di analita (standard) con le quali si costruisce una curva di taratura.

INDIRETTO NON COMPETITIVO

Indiretto = antigene (proteico) legato al pozzetto

Non competitivo = l'intensità di colore è proporzionale alla presenza di analita

1) Preparazione della piastra

Coating = aderimento antigene alla piastra

Aggiungere antigene in ogni singolo pozzetto.

pozzetto che si fissa spontaneamente legandosi alla plastica del pozzetto.

Blocking= Tutto il pozzetto viene saturato con una proteina inerte

Analisi quali e quantitativa degli ANTICORPI (es. quantificazione immunoglobuline IgG o IgE nell'antisiero)

Lavaggio: Pozzetti svuotati e lavati per rimuovere eccesso di antigene

Anticorpo primario→ Specie "in difetto"; dalla sua quantità dipende quanto anticorpo secondario si attacca e quindi quanto colore si forma

Lavaggio: Pozzetti svuotati e lavati

Aggiunto anticorpo secondario, in eccesso, coniugato all'enzima

Lavaggio: Pozzetti svuotati e lavati per rimuovere eccesso di antigene

Si pone nei pozzetti SUBSTRATO che diventerà prodotto

Reazione deve essere bloccata e avviene misurazione assorbanza delle soluzioni

- 2 Casi: Quantità di enzima presente in ogni pozzetto dipende dalla quantità di anticorpo nel campione da analizzare

↑Tanti anticorpi = si legheranno

anticorpo primario e secondario = Tanta quantità enzima presente → tanto coloreo ↓ anticorpo

Pochi anticorpi = si legheranno primario e secondario = Bassa quantità enzima presente → poco colore-

Per realizzare standard si usano soluzioni di anticorpi a titolo noto (= che contengono quantità note e variabilidi anticorpi)-

Anche in questo caso si può realizzare una curva di taratura 27INDIRETTO COMPETITIVOo Competitivo = intensità colore inversamente proporzionale alla presenza di analitao Indiretto = antigene legato al pozzettoo Quantificare ANTIGENE (analita) presente nel campione1) 2 antigeni →

1. Comprato usato per coating del pozzetto (comprato stesso antigen