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Spettrofotometria di assorbimento atomico

La spettrofotometria di assorbimento atomico è una delle tecniche più usate oggi per analisi di tipo quantitativo su campioni di ogni genere, e che abbiano concentrazione molto bassa. Il principio su cui si basa è il seguente: il campione viene atomizzato e bersagliato da una radiazione di lunghezza d'onda opportuna (compresa nella regione UV/visibile), che per effetto dell'assorbimento atomico diminuisce la sua intensità;
questa diminuzione può essere collegata alla concentrazione dell'elemento nel campione tramite una legge simile a quella di Beer.
L’assorbimento è direttamente proporzionale all’intera popolazione di atomi presenti nel cammino ottico e quindi alla concentrazione dell’elemento nel campione.
L’assorbimento atomico è seguito da un processo di rilassamento che avviene per via non radiante (termica) o radiante (emissione di radiazioni).


L'atomizzazione è un sistema di riscaldamento, realizzato attraverso una fiamma o uno speciale fornetto di grafite, che serve a formare atomi liberi ma ancora allo stato fondamentale nel cammino della radiazione di analisi. Gli atomi in questa forma costituiscono il cosiddetto vapore atomico. Una volta colpiti dalla radiazione luminosa, gli atomi liberi si eccitano, cioè uno dei loro elettroni esterni acquista energia e va ad occupare un orbitale a maggiore energia, causando così un assorbimento caratteristico. Questo assorbimento, che dipende dalla quantità di atomi presenti nel campione, è proporzionale alla loro concentrazione secondo la legge:
A=xbN
in cui x è il coefficiente spettrale di assorbimento atomico, in pratica il corrispettivo dell'assorbimento molare, b è lo spessore del campione, e N e il numero totale di atomi liberi.
Ogni atomo ha un insieme di possibili transizioni elettroniche che corrispondono alle transizioni di ciascun suo elettrone. Ogni transizione corrisponde a un preciso assorbimento e produce una precisa riga spettrale o di risonanza.


Strumentazione

II raggio emesso dalla sorgente attraversa il sistema di atomizzazione, contenente il campione sotto forma di vapore atomico, e giunge al monocromatore che elimina_le radiazioni che non interessano ai fini analitici;
la radiazione monocromatica passa poi al rivelatore, che consentirà l'elaborazione del messaggio da parte del microprocessore. La radiazione uscente dalla sorgente, prima di raggiungere il sistema di atomizzazione, viene modulata attraverso un chopper*: questo è un sistema che consente di ottenere una radiazione pulsante. La modulazione viene effettuata per distinguere la radiazione emessa dalla sorgente da quella emessa, inevitabilmente, dal sistema di atomizzazione. Il rivelatore, infatti, prenderà in esame solamente la radiazione pulsante, cioè quella originata dalla sorgente. Lo spettrofotometro per AA può essere monoraggio e doppio raggio. Il sistema doppio raggio consente di compensare le variazioni di intensità della sorgente o di sensibilità del rivelatore.

(* un dischetto che ruota costituito da due settori: uno a specchio che riflette la radiazione, e uno vuoto che la fa passare)
Sorgenti
L’AA è usato per le analisi quantitative, quindi non è necessaria una lampada che emetta in tutto il campo spettrale. E' indispensabile usare sorgenti che emettano spettri di righe, che hanno bande passanti molto piccole (0,002 nm). Per evitare che l’energia assorbita dal campione sia troppo bassa rispetto a quella emessa dalla lampada è necessario usare radiazioni molto monocromatiche e molto intense, per compensare le dispersioni di energia che si verificano nel sistema.
Lampada a catodo cavo: è la più usata , è costituita da un bulbo in vetro con finestra di quarzo e contiene al suo interno un catodo e un anodo; l’ambiente interno è riempito di gas (Ar o Ne). Il catodo è costituito da una capsulina, che contiene l’elemento caratterizzante della lampada. Quando viene applicata una d.d.p. agli elettrodi, il gas di riempimento si ionizza (+); gli ioni positivi urtano il catodo provocando l’aspulsione degli atomi superficiali vaporizzati, i quali eccitati dal gas di riempimento, ritornano allo stato fondamentale emettendo energia radiante, quella propria dell'elemento in esame, ossia il suo spettro di emissione. Confrontare con " spettri di emissione e spettri di assorbimento" dello stesso elemento. Ogni elemento assorbe le specifiche  (non tutte) del suo spettro di emissione (lo spettro di emissione è in genere più complicato per i diversi livelli vibrorotazionali dello stato eccitato da cui l'atomo parte per dare l'emissione). Il monocromatore seleziona la  di massimo assorbimento, o “radiazione analitica” (cfr. pg 4). Queste lampade possono essere a singolo elemento o multi elemento (meno sensibili di quelle a singolo elemento perché possono dare sovrapposizione fra le righe spettrali). Servono per quasi tutti gli elementi, presentano problemi con gli alcalini e con i volatili (durano poco) come As, Se, Cd.

Lampada a radiofrequenza: richiede condizioni specifiche per essere utilizzata. La lampada è costituita da un bulbo di vetro in cui è inserita la bobina di un generatore di radiofrequenze. All'interno della bobina è inserito un bulbo di quarzo contenente l'elemento. L'energia del campo di radiofrequenze fa vaporizzare l'elemento i cui atomi, eccitati, emettono lo spettro caratteristico. Queste lampade consentono una maggiore sensibilità, hanno vita più lunga rispetto a quella a catodo cavo ma esistono solo per certi elementi.


I sistemi di atomizzazione principali sono due: quello a fiamma e quello a fornetto di grafite.
Il sistema a fiamma è quello più diffuso. Sfrutta una fiamma, alimentata a gas, in cui viene nebulizzata una soluzione del campione. È costituito da un tubo cilindrico (bruciatore) diviso in due zone, la camera di nebulizzazione e la camera di premiscelazione; il tutto è collegato ad una testata dove avviene la combustione e l’atomizzazione. Il campione viene aspirato nel nebulizzatore (2-6 mL/min), trasformato in aerosol e immesso nella camera di premiscelazione, dove si mescola con il gas combustibile e con il gas comburente (ossidante, es.: aria, protossido di azoto). Il gas comburente serve per mantenere viva la fiamma, ma funge anche da gas di trasporto nel nebulizzatore; ciò consente di variare il flusso del nebulizzatore senza variare il flusso alla testata. Nella camera di premiscelazione è presente un dispositivo che serve per abbattere le goccioline di soluzione troppo grosse. La velocità con cui il nebulizzatore aspira deve essere regolata ed ottimizzata ogni volta si inizi un’analisi; la velocità non deve superare un certo valore perché abbasserebbe la temperatura della fiamma riducendo l’efficienza di atomizzazione (quindi, la sensibilità dell’analisi). Tutti i materiali sono inerti. La testata del bruciatore è in titanio, per resistere alla corrosione e al calore, le testate possono essere diverse (ad esempio di diversa larghezza). Il resto è rivestito da materiale plastico resistente o è in acciaio speciale.

Possono essere usati vari tipi di fiamma a seconda dell’elemento da analizzare:
— Fiamma aria-acetilene: è la più utilizzata perché è adatta per l'analisi di moltissimi metalli. La temperatura di fiamma è di 2300°C (si usa una testata da 10 cm)
— Fiamma aria-idrogeno: è particolarmente adatta per i metalli alcalini, arriva fino a temperature di 2050°C, (testata bruciatore 5 cm)
— Fiamma protossido di azoto-acetilene: adatta per elementi che tendono formare composti indissociati (come Al e Mo, che formano con ossigeno composti refrattari) e che richiedono temperature molto elevate, questa fiamma arriva 2800°C (testata apposita da 5cm)
— Fiamma aria/argon-idrogeno: fiamma a temperatura molto bassa 300-800°C (testata a tre fenditure). Si usa per gli elementi volatili come As, Sb, Cd.

Nei bruciatori con premiscelazione, solo una piccola frazione di soluzione aspirata giunge alla fiamma. Nei sistemi a navicella è possibile aumentare i limiti di rivelabilità, aumentando la quantità di campione alla fiamma. Una navicella di tantalio (contiene da pochi μl a 1 ml) può scorrere dentro e fuori la fiamma mediante un sistema meccanico. Prima si evapora il solvente, ponendo la navicella vicino alla fiamma, poi si spinge la navicella sulla fiamma. Il campione si volatilizza e i vapori atomici intercettano la radiazione proveniente dalla sorgente.
La coppetta di Delves consente di effettuare misure più precise. È costituita da una coppetta di nichel, al di sopra della quale è posto un tubo orizzontale, in cui passa la radiazione. I vapori generati dalla coppetta passano nel tubo attraverso un foro centrale e fuoriescono dai lati. In questo modo gli atomi rimangono più a lungo nel cammino ottico del raggio e l’assorbanza aumenta.

II fornetto di grafite è un sistema interamente automatizzato che consente di analizzare oltre a soluzioni in concentrazioni molto basse, anche campioni solidi. Consente di abbassare notevolmente (1000 volte) i limiti di rivelabilità ([c]10-12), inoltre consente di lavorare su aliquote molto piccole di campione.
Un piccolo volume di campione viene inserito all'interno di un tubo di grafite che è posto sul cammino ottico della radiazione eccitante. Nel tubo fluisce un gas inerte allo scopo di espellere l'aria presente, che potrebbe interferire nell'analisi, e di rendere l'ambiente adatto a mantenere il campione allo stato elementare. Dopo il caricamento il tubo viene riscaldato elettricamente in varie tappe. Queste tappe sono finalizzate a:
— rimozione del solvente o essiccamento del campione,
— incerenimento del campione,
— atomizzazione
La misura dell'assorbimento si effettua sui vapori atomici che si liberano nell'ultima fase di riscaldamento. Successivamente il tubo di grafite viene ripulito raggiungendo elevate temperature e facendo fluire al suo interno il gas inerte. Il segnale che si ottiene dal rivelatore con questa tecnica è un picco la cui altezza è direttamente proporzionale alla concentrazione dell'elemento da analizzare.

Altri sistemi di atomizzazione senza fiamma
Nel caso analizzassimo il mercurio useremmo il sistema a vapori freddi. Il campione viene fatto reagire con un potente riducente (SnCl2 o NaBH4). Gli atomi di mercurio (Hg0) vengono allontanati dalla soluzione facendo gorgogliare l’aria nella soluzione, che viene successivamente essiccata e indirizzata sulla cella a tubo orizzontale di uno spettrofotometro attraversata dalla radiazione. Con questo metodo è possibile rilevare tracce di mercurio fino a 9 ng/l.
Nel sistema di campionamento a idruri volatili si preparano gli idruri dei metalli da determinare per reazione con NaBH4. Gli idruri vengono trascinati, mediante correnti di Argon, su una fiamma argon-idrogeno. Il segnale è un picco, la cui altezza è direttamente proporzionale alla concentrazione del metallo nel campione Con questa tecnica i limiti di rivelabilità si abbassano fino al di sotto dei μg/l.
Il monocromatore serve per rendere la radiazione, uscente dal sistema di atomizzazione, il più possibile monocromatica eliminandone tutte le componenti spurie. Viene selezionata la "riga di risonanza" o "riga analitica" (quella di massimo assorbimento. Se il campione è molto concentrato e dà un'assorbenza eccessiva con questa riga, piuttosto che diluire, operazione che porta ad errori, è possibile selezionarne un'altra). Per fare questo in genere si usa un reticolo a dispersore montato su una piattaforma girevole che, ruotando, permette che le varie componenti monocromatiche, focalizzate da uno specchio concavo, vengano dirette all'uscita del monocromatore. A questa uscita è collegato il rivelatore che rielabora il messaggio fornendo un grafico dell'assorbimento. Allo strumento è inoltre collegato un microprocessore che consente la memorizzazione dei dati, l'immissione dei comandi, ecc.
Dato che lo strumento è costituito da molte parti mobili è necessario effettuare, prima di procedere all'analisi, l'ottimizzazione di tutte queste parti:
— allineamento ottico della lampada: fare in modo che il suo raggio colpisca il sistema di atomizzazione e quindi il rivelatore con la massima intensità
— allineamento del sistema di atomizzazione: collocato in modo che sia investito in pieno dalla radiazione d'analisi
La determinazione quantitativa degli analiti si effettua col metodo della retta di taratura, che consiste nel costruire una retta di taratura preparando soluzioni (standard) a concentrazione nota e misurandone l'assorbanza. Nel preparare la retta si cerca di stare al disotto dell'intervallo di linearità, punto oltre il quale il rapporto assorbanza/concentrazione non è più direttamente proporzionale. Ogni elemento ha un suo intervallo di linearità ottimale in cui l'errore relativo è minimo.
Se la matrice è complessa si usa il metodo dell'"aggiunta" (in pratica si traslano gli assi). Si considera il campione come fosse a concentrazione zero e si fanno più aggiunte misurate dell'analita. La concentrazione reale del campione si trova per estrapolazione sul semiasse negativo delle x.

Quanto segue non è da studiare, ma da considerare per rendersi conto dei problemi che potrebbero presentarsi. Nell'esposizione dell'argomento basteranno un esempio o due.

Sistemi di correzione dell’assorbimento di fondo

Interferenze non spettrali
Possono essere di vario tipo:
• I. Fisiche: dipendono dalla viscosità del campione; essa si comporta in modo diverso nella fase di nebulizzazione, impedendo la riproducibilità delle misure, perché varia il numero degli atomi che arrivano alla fiamma.
• I. Chimiche: dipendono dalla presenza di specie che possono formare composti termicamente molto stabili. La presenza di fosfati interferisce nella determinazione del calcio, perché si forma il pirofosfato, che non si dissocia (l’assorbimento diminuisce). Questa interferenza può essere eliminata aggiungendo una piccolissima quantità di lantanio, che dà un fosfato più stabile di quello di calcio. Oppure si può aggiungere un eccesso di EDTA che complessa il calcio, il chelato Ca-EDTA si decompone facilmente rapidamente in fiamma e quindi non interferisce.
• I. Da ionizzazione: La fiamma, avendo elevate temperature, può causare una parziale ionizzazione dell’elemento. Per ovviare a questo problema si aggiunge un’altro elemento facilmente ionizzabile.

Interferenze spettrali
Possono essere di vario tipo:
• I. Da emissione: avvengono quando la radiazione emessa dall’elemento eccitato si sovrappone a quella della lampada. Questo si può evitare usando luce pulsata.
• I. Spettrali atomiche: avvengono quando nella matrice si trova un elemento, diverso dall’analita, che dà una riga spettrale vicino alla riga analitica; questo causa un aumento dell’assorbanza. Le sovrapposizioni non sono molto frequenti perché la lampada fornisce bande passanti molto strette (0,002 nm).
• I. Spettrali molecolari: la presenza di specie molecolari presenti nella fiamma può generare notevoli errori nell’analisi. Per esempio la presenza di calcio nella matrice di un campione di bario può provocare un errore (in eccesso) nella determinazione del bario. Infatti, il radicale CaOH assorbe 554 nm, molto vicino alla riga di assorbimento del bario (553,6). Questo tipo di interferenza può essere minimizzato usando fiamme con temperature più elevate, in questo modo tutto è atomizzato.
• I. Di scattering: nella fiamma possono esservi particelle solide o gocce di soluzione non perfettamente vaporizzate che provocano fenomeni di diffusione della luce (scattering), aumentando l’assorbimento. L’intensità della radiazione diffusa è inversamente proporzionale alla quarta potenza della lunghezza d’onda. Questo fatto può creare problemi a lunghezze d’onda piccole (< 250 nm).
Correzione dell’assorbimento di fondo

Metodo delle linee
Per eliminare il rumore di fondo (r.d.f) si misura il segnale del r.d.f. misurando l’assorbanza vicino al picco dell’analita. Per ottenere il valore di assorbanza dell’analita ripulito dal r.d.f si sottrae l’assorbanza del r.d.f all’assorbanza dell’analita misurata.
Sistema a sorgente continua
Si colpisce il campione con radiazioni pulsate emesse da una sorgente continua (bande passanti di 0,2 nm) e da una lampada a catodo cavo (bande passanti di 0,002 nm). Il rivelatore legge sia il valore di assorbanza dell’analita, colpito dalla radiazione proveniente dalla lampada a catodo cavo, insieme al rumore di fondo; sia il valore di assorbanza dell’analita colpito dalla radiazione emessa dalla lampada continua, che avendo bande passanti grandi, legge solo l’assorbanza dovuta al valore del r.d.f e non quello dell’analita che è troppo piccolo, quindi insignificante.

Effetto Zeeman
Quando si applica un forte campo magnetico alla radiazione emessa o assorbita, si ottiene uno sdoppiamento della riga caratteristica. Dopo l’azione del campo magnetico si ottengono due picchi in più a distanza simmetrica dalla riga caratteristica, tutti e tre sono di luce polarizzata. La luce polarizzata avendo una sola componente, si misura direttamente al luce depurata dal r.d.f..
Sistema Smith
Se aumento il flusso della corrente alla lampada, essa aumenterà la propria luce (fino ad un valore massimo). Aumentando di colpo la corrente alla lampada, otterrò uno sdoppiamento della lunghezza d’onda di lavoro dell’analita, che adesso assumerà valore molto basso, quindi non misurerò l’assorbanza dell’analita, bensì il r.d.f.. Basta sottrarre all’assorbanza del campione il segnale del r.d.f misurato, e otterremo il segnale pulit

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