Esplorazione delle biotecnologie: dalle piante GM al progetto genoma umano

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Differenze tra monocotiledoni e dicotiledoni

Qual’è la differenza fra piante monocotiledoni e dicotiledoni?

Monocotiledoni: Piante più evolute, più diffuse e con poche pretese

Dicotiledoni: Piante contenente due cotiledoni (prime due foglioline sviluppate che nutrono la pianta inizialmente).

2.
Come e in cosa è utilizzato il metodo biolistico?

É il metodo più utilizzato per la modifica del genoma vegetale delle piante monocotiledoni.

Vengono sparate particelle di oro o tungsteno su determinate zone della pianta aventi sulla loro superficie un genoma artificiale, che verrà inserito all’interno delle cellule vegetali non distrutte dall’impatto, ma con parete cellulare leggermente lesionata.

3. Perché l'agrobacterium tumefaciens non infetta le piante monocotiledoni?

In quanto piante più resistenti naturalmente, l'agrobacterium tumefaciens non riesce a inserire il suo plasmide Ti all’interno della pianta in quanto respinto dalla pianta stessa.

4.

Quale caratteristica permette al batterio di inserirsi nel genoma vegetale?

Il batterio per chemiotassi, ovvero l’abilità naturale di riconoscere sostanze organiche estranee all’organismo, riconosce il genoma vegetale delle piante dicotiledoni. Successivamente il plasmide Ti entrerà all’interno del genoma vegetale e, se non modificato artificialmente, introdurrà l’oncogene T, responsabile del tumore.

5.

Modifiche al plasmide Ti

Quali modifiche vanno apportate al plasmide Ti in modo tale da poter inserire all’interno del genoma vegetale un genoma esogeno?

Eliminazione della citochinina e della auxina, allontanamento del gene codificante per l’opina, riduzione delle dimensioni del plasmide Ti, in-alterazione dei confini del T-DNA di origine, inserimento di una regione polilinked per favorire l’introduzione del genoma artificiale, dotare il plasmide di un sito d’origine, inserimento del gene marcatore per consentire la selezione di cellule resistenti alla Kanamicina.

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Transgeni e resistenza ai trasporti

A cosa servono i transgeni e come si modifica geneticamente una pianta?

Le piante transgeniche (GM) presentano un DNA modificato attraverso le tecniche di ingegneria genetica. Questa tecnica consente di introdurre nuovi tratti genetici in una determinata pianta attraverso l’inserimento artificiale di una o più sequenze di geni, chiamati transgeni (provenienti da organismi di diversa specie).

2. Perché una pianta resistente ai trasporti a lunga distanza è un vantaggio? Secondo te, quale problema potrebbe nascondere questo vantaggio?

Resistenza ai trasporti a lunga distanza: le piante raccolte quando ancora non mature riescono a maturare durante il trasporto (conservabilità).

Obiettivi: miglioramento della conservabilità e della qualità, la resistenza ai parassiti, al calore e al freddo.

3.

Golden rice e piante GM

Perché il Golden rice è così importante?

Il riso lavorato è l’alimento di base per una grande fetta della popolazione mondiale, ma i metodi tradizionali di coltivazione non sono abbastanza produttivi da poter garantire un'alta concentrazione di vitamina A(causa cecità, soprattutto nei tropici).

Il riso transgenico contiene una maggior quantità di beta-carotene (precursore della vitamina A).

4. Quali piante GM possono dare effetti negativi alla salute del consumatore? Quali possono invece dare effetti positivi?

Svantaggi: possano provocare allergie ad alcune persone. o possano portare alla nascita di insetti giganti.

Vantaggi: con gli ogm si possono produrre delle proteine per uso terapeutico, sono di tre tipi: anticorpi, proteine e vaccini.

5. Secondo il tuo parere, perché in italia è vietata la coltivazione di GM, mentre è consentita la vendita?

Anche se le piante geneticamente modificate offrono una potenziale soluzione alla scarsità di cibo nel nostro pianeta, la fattibilità di creare coltivazioni di piante GM rimane discutibile. L’incremento di produzione eliminerebbe la fame sì, ma nasconderebbe costi in termini ambientali e di salute.

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Bioremediation e fitodepurazione

Cos’è la bioremediation e come funziona in generale?

Tecniche di bonifica ambientale efficaci e versatili che sfruttano il metabolismo microbico di

determinati organismi per biodegradare o detossificare sostanze inquinanti

2. Qual’è la differenza tra le tecniche ex situ e in situ?

Può essere applicabile “ex situ” o “in situ”: rimuovendo la matrice contaminante per trattarla in un’area dedicata del sito contaminato, oppure no.

3. Illustrare la tecnica di fitodepurazione in situ

● Tecnica utilizzata per aree ampie con bassa concentrazione di agenti contaminanti

● Crescita di piante su terreni contaminati così i composti inquinanti possano filtrare attraverso le radici e accumularsi in vari organi della pianta

● Molte piante possono accumulare metalli pesanti essenziali allo sviluppo assorbendoli dal suolo o dall’acqua e utilizzarli per la loro crescita.

● Condizioni da valutare: profondità contaminazione del suolo, condizioni climatiche, biodisponibilità dei contaminanti, tasso di crescita della pianta, area di crescita delle radici

4. Quali sono le principali tecniche ex situ e cos’è il compostaggio?

Bioreattori, Landfarming e Compostaggio.

Compostaggio: processo biologico aerobico controllato dall’uomo, che consiste nella bio-ossidazione e umificazione di un misto di materie organiche tramite batteri e funghi, e produce il compost.

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Colture cellulari e bioreattori

Quali sono i principali tipi di colture cellulari e le loro differenze?

Le cellule che sono mantenute in coltura possono derivare da:

Colture cellulari primarie: direttamente dalla dissociazione di un tessuto

Colture secondarie o terziarie: possono derivare da colture precedenti

2. Quali sono le origini delle mutazioni tra le colture derivanti dalla stessa linea cellulare.

Genetica: mutazioni, perdita di cromosomi o parte di essi

Epigenetica: cambiamenti fenotipici ereditabili da una cellula o un organismo, in cui non si osserva una variazione del genotipo (ad esempio: metilazione del DNA → Il processo consiste nel legame di un gruppo metile (-ch3) ad una base azotata.).

3. Nomina i principali strumenti per la coltivazione in vitro.

Cappa a flusso laminare: crea un ambiente pulito grazie alla filtrazione dell'aria.

Incubatore: mantiene costanti le condizioni fisiologiche.

Soluzione salina isotonica: è la base di un mezzo di coltura

antibiotici e antimicotici: aggiunti al mezzo di coltura per prevenire contaminazioni batteriche e fungine. Siero fetale bovino: arricchisce i mezzi di base,

4. Quali sono le differenze principali tra i diversi tipi di bioreattori?

Bioreattore → dispositivo in grado di fornire un ambiente adeguato alla crescita di microrganismi.

Bioreattori a ciclo chiuso: le cellule crescono fino al raggiungimento della fase stazionaria di crescita, il terreno resta sempre uguale ed il sistema rimane chiuso. Elemento sufficiente di stress la mancanza di uno dei loro nutrienti.

Bioreattori a ciclo semicontinuo: semicontinuo perché già a metà della crescita esponenziale le cellule cominciano a produrre metaboliti secondari. Bisogno di ulteriori elementi di stress, cambiamento nel terreno di coltura, ad esempio per la massiccia emissione di un catabolita secondario di rifiuto, tossico per le cellule e pertanto elemento di stress.

Bioreattori a ciclo continuo: prelievo in continuo piccolissime aliquote di cellule e terreno ad intervalli di tempo regolari e ravvicinati

Bioreattori a cellule immobilizzate: affine al ciclo chiuso, se ne differenzia perché vengono immessi nel bioreattore, che rimane chiuso, composti gelatinizzanti o supporti solidi.

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Clonazione animale e scnt

Che cos'è la clonazione? (quella animale)

La clonazione animale consiste nel realizzare la copia di un animale essenzialmente uguale all'originale.

2. Come funziona la scnt?

Essa consiste nel realizzare una copia genetica di un animale sostituendo il nucleo di un ovulo (cellula uovo) non fecondato con il nucleo di una cellula del corpo (somatica) di un animale in modo da ottenere un embrione.

3. Riassumi la storia della clonazione animale fino a Dolly.

Nel 1997 la notizia, apparsa sulla rivista «Nature» della nascita di un agnello a partire da un oocita enucleato nel quale era stato trasferito il nucleo di una cellula somatica di pecora adulta, colse di sorpresa la comunità scientifica internazionale.

4. Quale era la difficoltà nella clonazione dei primati, ed è stata superata?

A differenza di altri mammiferi i primati si erano rivelati in qualche modo "resistenti" alla clonazione, perché portatori di diversi geni in grado di interrompere lo sviluppo della cellula uovo. Si è stato superato.

5. In italia è possibile effettuare queste pratiche di clonazione?

"La tecnologia è già disponibile”, ma per ora si sta evitando di usarla, soprattutto a causa dell’opinione pubblica.

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OGM in Italia e nel mondo

Cosa è permesso fare in Italia con gli OGM al giorno d’oggi (in base alle leggi)?

Situazione odierna controversa (no coltivazione, sì utilizzo e ricerca in laboratorio)

2. Quali paesi coltivano la maggior parte degli OGM? Quali sono le colture transgeniche più diffuse? Colture transgeniche più diffuse: Soia, Mais e Cotone. Paesi che coltivano la maggior parte degli OGM: USA, Brasile e Argentina.

3. In cosa consisteva l’importante proposta fatta all’ONU, che vedeva un fattore chiave nell’utilizzo di OGM?

Progetto proposto all’ONU al fine di aiutare paesi del terzo mondo tramite la coltivazione di OGM.

4. Quali sono gli argomenti a sostegno del fatto che gli OGM siano dannosi per la nostra salute?

● Modifica l’equilibrio terrestre, la biodiversità e diversificazione delle colture.

● Monopolio colture

● Possibile dannosità per la salute

5. Quali caratteristiche degli OGM vengono invece identificate come importanti e vantaggiose? utili per l’ambiente, per l’economia e anche per il benessere dell’umanità: cibi più nutrienti fondamentali nella lotta alla fame nel mondo.

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Biocombustibili e biomassa

Cos'è un biocombustibile e cos’è una biomassa ?

Il biocombustibile è un combustibile ottenuto in modo indiretto dalle biomasse.

La parola biomassa denota la materia prima biologica di cui è composto il carburante.

2. Quali sono i benefici e i problemi dei biocombustibili ?

● Rinnovabilità

● Possibile diminuzione emissioni CO2 rispetto alternative fossili se piante usate assorbono stessa quantità che viene prodotta

● Possibilità di non usare campi con avanzamenti

Contro:

● Deforestazione

● Terre per la produzione insufficienti che possono portare a scarsità alimentare

● Quantità di acqua richiesta per coltivazioni

3. Quante generazioni di biocarburanti esistono e caratteristiche ?

● Prima generazione: combustibili ottenuti da colture alimentari coltivate su terreni coltivabili.

● Seconda generazione: combustibili ottenuti da biomasse lignocellulosiche o legnose, o residui/rifiuti agricoli.

4. Produzione bioetanolo e biodiesel ?

Bioetanolo: prodotto dalla fermentazione di zuccheri, amidi o cellulosa.

Biodiesel: È prodotto da oli o grassi mediante transesterificazione.

5. Differenza tra processo solare fotochimico e termochimico nei combustibili solari ?

● Processo fotochimico solare, si produce idrogeno mediante elettrolisi. Si utilizza una cella fotoelettrochimica, in cui si converte la luce in una corrente elettrica che viene utilizzata per la divisione dell'acqua.

● Processo solare termochimico, l'acqua viene scissa in idrogeno e ossigeno utilizzando il calore solare diretto, piuttosto che l'elettricità.

Southern Blot e PCR

1) Cosa permette di determinare la Southern Blot?

Fine della tecnica è quello di determinare la presenza o l’assenza di una specifica sequenza nel genoma di un organismo.

2) Come avviene il trasferimento del DNA dal gel d’agarosio al foglio di nitrocellulosa?

Il gel di agarosio viene coperto da un foglio di nitrocellulosa, o di nylon, il quale è carico positivamente.La soluzione alcalina, per via della capillarità, attraversa il gel di agarosio e il foglio di nitrocellulosa portando con sé i frammenti di DNA che si legano elettrostaticamente a quest’ultimo

3) Cos'è una sonda marcata e qual è il suo scopo nella Southern Blot?

Sonda è complementare a sequenze specifiche alle quali, identificandole, si lega. Il legame viene detto ibridazione

4) Quali sono gli svantaggi della Southern Blot?

Richiede molto tempo e discrete quantità di DNA

1. Quali sono i limiti della PCR? è necessario conoscere la sequenza del DNA da amplificare per sintetizzare i primers; per analizzare il campione bisogna aspettare la fine della reazione;

2. Perché l’utilizzo della Taq polimerasi è considerato un aspetto svantaggioso nella Pcr? Taq polimerasi manca dell’attività 3’→5’ esonucleasica;

3. Qual è il principio che sta alla base della Real time PCR? amplificare e quantificare il DNA in maniera simultanea.

4. Che cos’è un fluorocromo e che ruolo ricopre nella Real time Pcr?Durante la replicazione si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all’aumento del numero di copie dell’amplicone.

5. Perché l’utilizzo di sonde è più accurato rispetto a quello delle molecole fluorescenti? Esso utilizza un rna a sequenza specifica o una sonda basata su dna per quantificare solamente il dna contenente la sequenza della sonda; quindi, l'uso di una sonda rivelatrice incrementa significativamente la specificità.

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Microchip e DNA Microarray

Che cos’è un microchip?

Un microarray di Dna è un insieme di microscopiche sonde di DNA attaccate ad una

superficie solida come vetro, plastica, o chip di silicio formanti un array (matrice).

2. Quali sono i principali step della tecnica Dna Microarray? Spiega brevemente

Deposizione delle sonde sul supporto rigido → raccolta dei campioni (isolamento dell’mRna, creazione del cDna contrassegnato) → ibridazione dei campioni fluorescenti sul microarray → lettura dei valori di fluorescenza, effettuata tramite apposito scanner → analisi dati ottenuti.

3. Quali sono le differenze tra metodo Affymetrix e metodo Stanford?

- Stanford: metodo per la stampa del DNA tramite un arrayer robotico; utilizzo di aghi su cui viene caricato il clone di Dna genomico;

- Affymetrix: metodo per la sintesi in situ in posizioni definite di oligonucleotidi (attraverso la fotolitografia) e utilizza un algoritmo di calcolo per sintetizzare la serie di oligonucleotidi.

4. In che cosa consiste la fotolitografia?

Processo di sintesi di luce diretta in cui i linker sintetici modificati con gruppi protettivi, rimovibili con la luce, sono attaccati alla superficie del vetrino. La luce viene diretta attraverso una maschera per deproteggere e attivare i gruppi selezionati. I nucleotidi protetti possono così accoppiarsi ai siti attivati.

5. A che scopo viene applicata questa tecnica?

I Dna microarrays sono utili nell’identificazione di varie malattie come il cancro, nella scoperta e sviluppo di farmaci, nella scoperta dei geni, nella ricerca tossicologica, nel riconoscimento batterico e nella rivelazione della resistenza ai farmaci.

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Knock out genico nei topi

In che cosa consiste essenzialmente il knock out genico?

Un topo knockout è un topo geneticamente modificato in cui i ricercatori hanno inattivato un gene esistente sostituendolo con un pezzo artificiale di DNA .

2. Perché questa tecnica viene utilizzata sui topi ?

Gli esseri umani hanno in comune molti geni con i topi. Inoltre i topi knockout offrono un contesto biologico e scientifico in cui sviluppare e testare farmaci e altre terapie.

3. A che scopo viene utilizzata tale tecnica?

L'osservazione delle caratteristiche dei topi knockout fornisce ai ricercatori informazioni che possono essere utilizzate per comprendere meglio come un gene simile possa causare o contribuire alla malattia negli esseri umani.

4. Come viene effettuato il knock out genico ?

In una coltura di cellule staminali embrionali si inattiva un gene con tecniche molecolari. Le cellule così ottenute vengono iniettate in una blastocisti che viene a sua volta impiantata nell’utero di una femmina pseudogravida, la quale darà vita a una progenie chimerica. Questa progenie presenta cellule che hanno uno dei due alleli del gene di interesse inattivato. Una volta prodotti due animali eterozigoti, si fanno accoppiare, così da avere una nuova generazione con omozigoti per il difetto cercato.

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Tecnica Fish e marcamento

Qual è il principale scopo della tecnica Fish?

Questa tecnica può essere utilizzata per rilevare e localizzare la presenza o l'assenza di specifiche sequenze di DNA nei cromosomi

2. Perché è meglio un marcamento indiretto che diretto per la sonda?

Sono da preferire i metodi indiretti in cui il segnale è determinato dall'interazione di biotina o digossigenina legate ad un nucleotide sempre della sonda. Questo metodo permette la visualizzazione di un segnale migliore e più intenso, rispetto ad una marcatura diretta del nucleotide della sonda.

3. Qual è il vantaggio del metodo FISH per mappare le sequenze di un cromosoma?

La Fish può essere utilizzata per mappare la sequenze di uno specifico cromosoma, il vantaggio principale è che essa non dipende dalla ricombinazione e così può essere utilizzata nelle regioni cromosomiche dove è soppressa.

4. A cosa serve il metodo Fish negli studi clinici?

La Fish si applica anche in studi clinici per scoprire se un paziente è stato infettato da un agente patogeno.

5. Cosa succede nella Fiber-Fish?

Nella Fiber-Fish, i cromosomi interfasici vengono fatti aderire ad un vetrino in modo che siano allungati e distesi; i vetrini vengono esposti a una soluzione. La distensione dei cromosomi permette una risoluzione molto più elevata della FISH.

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Vaccini e Reverse Vaccinology

Cos’è un vaccino?

preparazione in grado di indurre risposta immunitaria, fornendo immunità specifica nei confronti di una particolare infezione.

2. Quando e perché nasce la Reverse Vaccinology?

1995 Rino Rappuoli sviluppò il vaccino contro MenB, più efficace grazie alla estrema variabilità delle proteine della membrana esterna

3. Quali sono le fasi di sviluppo della Reverse Vaccinology?

A) Sequenziamento genoma

B) Analisi bioinformatica

C) verifica sui batteri

D) sperimentazione sui topi

4. Cos’è e cosa fa Nerve?

Piattaforma di raccolta e di rielaborazione dei dati (raccolta dati → costruzione database → assegnazione ranking)

5. Quali sono i vantaggi dell’uso della Reverse Vaccinology?

Non richiede coltura del patogeno in vitro, riduce i tempi di sviluppo del vaccino, fattore di sicurezza maggiore, disponibilità spettro completo dei potenziali antigeni

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Cellule staminali e applicazioni

Cosa sono le cellule staminali e quali caratteristiche le differenziano da altre cellule?

Le cellule staminali sono cellule primitive, ossia non specializzate. Caratteristiche:

Autorinnovarsi: rinnovare se stesse attraverso la divisione cellulare; una delle due cellule che si originano in seguito alla divisione cellulare rimane staminale.

Specializzarsi: diventare cellule di tessuti o di organi specifici con funzioni particolari.

2. Vantaggi e svantaggi delle cellule staminali adulte

Vantaggi: 1)Possono essere estratte da una persona adulta e reimpiantate nella stessa persona, evitando problemi di incompatibilità. Possono essere usate anche per la terapia genica.

2) Non pongono problemi etici, per ottenerle non bisogna distruggere embrioni.

Svantaggi: sono difficili da estrarre e si moltiplicano poco, quindi se ne ottengono in quantità molto scarse, spesso insufficienti.

3. Cosa sono le cellule staminali ips?

Sono cellule staminali embrionali artificiali, prodotte in laboratorio a partire da cellule del corpo. Si comportano in modo molto simile alle cellule staminali embrionali, diventando capaci di formare tutti gli organi e i tessuti del corpo.

4. Un esempio in campo medico

Le cellule staminali della pelle sono usate per curare le vittime di gravi ustioni. Sono sufficienti pochi millimetri di pelle (ricavata dalle ascelle, che rimangono più protette dal danno) per far crescere la superficie necessaria a ricoprire tutto il corpo.

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Dna Fingerprinting e STR

Che cosa sta alla base del Dna Fingerprinting? Cosa sono le Str?

Il dna Fingerprinting è basato sulla quantità di STR o sequenze microsatellite in un determinato campione di Dna. Le sequenze microsatellite sono delle sequenze corte (3-4-5 basi) che si trovano in dei loci dei cromosomi nei quali non si trovano i geni, ma si trovano appunto le STR. E’ proprio la quantità di queste sequenze che differenzia il Dna tra gli umani.

2. Quali sono le 3 fasi tramite cui si svolge il processo che esamina il Dna?

Le tre fasi sono: estrazione del Dna; Isolazione e moltiplicazione delle Str; Confronto delle diverse impronte genetiche.

3. Come funziona l’estrazione del DNA da un campione di cellule?

Il campione di Dna viene messo in una provetta con diversi solventi (come estrazione dalla banana) e enzimi, cui attraverso diversi cambi di temperatura e centrifughe si ottiene un depositato, un pellet, che verrà poi seccato e diventerà il Dna genomico

4. Come si svolge il confronto tra più campioni di Dna?

Si svolge l’impronta genetica, e quindi tutto il processo precedente, per ogni campione di Dna, e poi si va a comparare i risultati dell’elettroforesi e le varie “linee fluorescenti” che indicano la quantità di STR in base alla grandezza.

5. In quali ambiti si usa questa tecnica?

Il Dna Fingerprinting si usa in tutte quelle situazioni in cui si deve risalire all’identità di una persona, come i test di paternità, il riconoscimento di un morto di guerra, le scene del crimine.

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Sistema Crispr-Cas e modifiche

Che cos’è il sistema Crispr-Cas (locus Crispr+ geni Cas) presente nel genoma di alcuni procarioti?

Il termine Crispr infatti, è l’acronimo di “brevi ripetizioni palindromiche(leggono anche al contrario) raggruppate e separate ad intervalli regolari”(in inglese). Significa che nel locus chiamato Crispr, presente nel DNA di alcuni batteri, ci sono queste particolari sequenze che si ripetono, ma intervallate da spacer di Dna diverso.

2. Qual è la funzione del sistema Crispr-Cas?

Alle sequenze CRISPR è associato un complesso di geni, il Cas (Crispr-Associated) che codifica enzimi in grado di tagliare il Dna, questo tipo di meccanismo serve al batterio per eliminare eventuali Dna estranei e patogeni (virali).

3. Cosa ha di speciale l’enzima Cas9?

Le Cas sono proteine/enzimi prodotte dai geni Cas dei sistemi Crispr-Cas, le loro funzioni sono associate al sistema immunitario adattativo procariotico.

Il vantaggio della Cas9 però sta nell’utilizzo della sola proteina “Cas9”, che non solo individua la sequenza da tagliare, ma esegue anche il taglio.

4. Quali modifiche hanno compiuto la Doudna e la Charpentier sull’enzima Cas9 per arrivare alla tecnica CRISPR-Cas9?

Doudna e Charpentier fecero modifiche a Cas9 per renderlo utile all’editing genetico. Trovando il modo di fornire artificialmente all’enzima l’informazione di cosa tagliare. Per prima cosa, hanno semplificato il complesso crisprRna / tracrRna per produrre quello che hanno chiamato Rna guida. Quindi, hanno sintetizzato un Rna guida con una sequenza target specifica di loro scelta per vedere se riuscivano a programmare con successo l’enzima Cas9.

5. Qual è la differenza tra knock in e knock out?

Il knock out è il risultato più comune, va a tagliare un pezzo di DNA, questo verrà riparato alla meglio dall’organismo e presenterà quindi diverse mutazioni.

Nel knock in invece è stato usato CRISPR-Cas9 per introdurre un nuovo gene. Si è scoperto che quando il DNA viene tagliato la cellula tenta di riparare la rottura utilizzando due possibili meccanismi:

→ Giunzione di estremità non omologhe

→ Riparazione diretta dall’omologia

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Diritti e principi etici

Cita due diritti in contrasto tra loro.

Diritto di conoscere e di non conoscere, in contrasto tra loro ma entrambi molto importanti.

2. In cosa consiste il principio di beneficenza?

Consiste nel massimizzare i benefici e minimizzare i danni, sia fisici che psicologici.

3. Perché gli Ogm nati grazie alla tecnica Crispr cas9 non devono sottostare alle leggi sugli Ogm?

Non devono sottostare alle leggi sugli Ogm perché nemmeno in laboratorio è possibile distinguere le mutazioni indotte dalla Crispr cas9 da quelle che avvengono in natura spontaneamente.

4. Spiega brevemente chi è He Jiankui.

He è un biofisico cinese che deve la sua reputazione ad un esperimento (novembre 2018) durante il quale ha modificato geneticamente il Dna di 2 embrioni umani (2 gemelle), alle quali aveva aumentato la resistenza all’infezione da Hiv. Nel dicembre 2019 è stato condannato a 3 anni di carcere.

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Sequenziamento e nucleosidi

A cosa serve questo processo?

Questa tecnica permette di determinare la sequenza/ordine dei nucleotidi e delle basi azotate ovvero un lungo elenco di lettere TGTACAA che definisce il genoma di un organismo.

2. Cosa sono in nucleosidi?

La tecnica in questione si basa su nucleosidi composti chimici modificati in modo artificiale → togliendo ai nucleotidi un gruppo fosfato.

3. Qual’è la differenza tra nucleosidi e nucleotidi?

I nucleosidi sono nucleotidi modificati che non presentano il gruppo fosfato e altre piccole differenze. Quindi a causa della loro struttura, impediscono che un altro nucleotide si leghi ad essi, in quanto non si possono formare legami fosfodiesterici.

4. Oggi il processo si svolge nello stesso modo?

Attualmente è possibile effettuare, anziché quattro reazioni distinte per ogni nucleotide modificato, una sola reazione utilizzando i 4 ddNtp marcati fluorescentemente in modo diverso tra loro. In questo modo ogni filamento di DNA emetterà una luce di colore diverso in base al nucleotide (ddNtp) col quale terminerà.

1.Pro e contro del Sequenziamento shotgun?

utilizzando grandi array di sequenziatori, l'intero processo è molto più efficiente rispetto agli approcci più tradizionali. Ma la sua capacità è sospetta, in particolare per i genomi con regioni ripetute.

2.Cosa si può sequenziale grazie alla nuove tecniche di sequenziamento?

DNA genomico:

● Intero genoma (la sequenza completa - piccoli genomi)

● Esoma (solo la parte di DNA trascritto in Rna, esoni)

● Geni mirati

● Ampliconi (solo prodotti Pcr)

Trascrittoma:

● Rna totale

● mRna

● small Rna (

3.Parlami del sequenziamento gerarchico del fucile.

Nel sequenziamento gerarchico, viene creata una mappa fisica del genoma a bassa risoluzione prima del sequenziamento. Da questa mappa, un numero minimo di frammenti vengono selezionati per il sequenziamento. Il genoma amplificato viene prima tagliato in pezzi più grandi e clonato in un ospite batterico utilizzando Bac. Poiché più copie del genoma sono state tranciate a caso, i frammenti contenuti in questi cloni hanno estremità diverse ed è possibile trovare un'impalcatura di contigui BAC che copra l'intero genoma. Questa impalcatura è chiamata percorso di piastrellatura.

Una volta trovato un percorso di piastrellatura, i Bac che formano questo percorso vengono tagliati a caso in frammenti più piccoli e possono essere sequenziati utilizzando il metodo del fucile su scala più piccola.

4. Elenca le varie tappe del processo comune delle NextGen sequencing.

● Estrazione

● Frammentazione attraverso: Ultrasuoni, trasposasi ingegnerizzate, nebulizzazione

● End repair in due modi: DNA polimerasi I, Mung bean nucleare

● selezione dei frammenti secondo le dimensioni

● A-tailing

● Amplificazione tramite Pcr

● Sequenziamento

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Progetto genoma umano e benefici

Cosa ha permesso di fare il sequenziamento del genoma umano?

• identificare tutti i geni umani

• determinare la struttura dei geni

• identificare le funzioni dei geni

• identificare i geni responsabili delle malattie mendeliane

2. Quali compagnie/istituti principali e quali paesi parteciparono al progetto genoma umano?

Paesi: Stati Uniti, Regno Unito, Francia, Germania, Giappone, Cina e India

Compagnie: due gruppi principali (National Istitute of Health e Celera) + si sono aggiunte collaborazioni di enti in USA, Canada, Gran Bretagna e Nuova Zelanda.

3. Obiettivo principale del progetto?

L’obiettivo principale era giungere a sequenziare il genoma umano. La mappatura dei geni umani è un passo importante per lo sviluppo di medicinali e trattamenti medici.

4. I retrovirus come incidono sul genoma umano?

I retrovirus si dimostrano direttamente coinvolti nelle fasi dello sviluppo umano. Inoltre queste sequenze si trovano solo nei primati, suggerendo che la loro funzione possa aver contribuito all'evoluzione di caratteristiche uniche che distinguono l'uomo dagli altri animali.

5. Benefici sulla medicina grazie al progetto?

● migliorare la diagnosi delle malattie

● identificazione di predisposizione genetica a specifiche malattie

● creazione di farmaci sulla base di informazioni molecolari

● produzione di “ farmaci personalizzati” sulla base dei profili genetici individuali

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Progetto encode e scoperte

Qual è l’obiettivo principale del progetto encode?

Si è passati dall’idea che il 3% del genoma avesse uno scopo e il resto fosse “inutile”, alla conoscenza che l’80% sono geni con uno scopo che si cerca di capire nei progetti encode. Lo scopo è per prevedere rischi di malattie geniche e per sviluppare nuove terapie per curare queste malattie.

2. A cosa era finalizzata la prima fase, o progetto pilota, e perché è fondamentale per le altre 3 fasi del progetto Encode?

La fase iniziale ha testato e paragonato vari metodi esistenti per l’analisi di determinate porzioni della sequenza del genoma umano. L’obiettivo è trovare i giusti approcci che consentano l’identificazione completa di tutti gli elementi funzionali del genoma umano. E’ fondamentale perché non avrebbe dato la possibilità alle fasi successive di scoprire ciò che hanno scoperto.

3. Quali sono stati i due metodi principali usati per la selezione manuale delle regioni del genoma durante la prima fase?

1) la presenza di geni o elementi della sequenza già studiati in precedenza 2) grande numero di dati della sequenza da comparare.

4. Rispetto alla precedente teoria che solo il 3% del genoma umano svolgesse una funzione, cosa si ha scoperto il progetto Encode?

Seconda fase: analizzare il genoma, i dati mostrano quali regioni sono trascritte nell'Rna, quali controllano i geni utilizzati in un particolare tipo di cellula e quali sono associate a un'ampia varietà di proteine. Nuova organizzazione del genoma umano:

-L’80% del genoma si trova sotto forma di elementi funzionali, di cui solo il 3% codifica proteine.

-Uno schizzo della struttura della rete dei fattori di trascrizione, che si legano al Dna per promuovere o inibire l'espressione dei geni. Struttura è molto intrecciata e complessa

-Circa il 75% di tutto il genoma è in grado di trasformarsi in Rna.

5. Quali sono le due cellule principali scelte e usate dai ricercatori?

1) HeLa S3, un adenocarcinoma cervicale, può essere trasfettata con molta efficienza e la maggior parte di queste cellule può sincronizzarsi col ciclo cellulare per facilitare gli studi della duplicazione del Dna.

2) Gm06990, un virus Epstein-Barr. Normale cariotipo e può essere stimolata con mitogeni (stimolano la mitosi), per attivare il segnale della trasduzione che fa attivare le regioni target già conosciute.