Replicazione del DNA - Procedimento

Replicazione del DNA - Procedimento

La replicazione del DNA è un processo semiconservativo ad altissima fedeltà. La precisione è garantita da tre passaggi sequenziali che portano il tasso di errore finale a 1 su 10¹⁰ nucleotidi aggiunti:
1. La DNA polimerasi seleziona il deossiribonucleoside trifosfato corretto da un punto di vista della complementarietà. Errore: 1 su 10⁵.
2. Correzione delle bozze (Proofreading 3' → 5'): Un'attività esonucleasica della polimerasi rimuove i nucleotidi mal appaiati al terminale 3'-OH. Errore: 1 su 10².
3. Riparazione dei mismatch: Interviene dopo la sintesi, correggendo gli errori sfuggiti alla polimerasi. Errore: 1 su 10³.
Ci sono alcuni enzimi importanti:
• Elicasi: Utilizza l'idrolisi di ATP per separare i filamenti.
• Proteine SSB (Single-Strand Binding): si legano al singolo filamento per evitare che si richiuda.
• DNA Primasi: Sintetizza brevi primer di RNA (circa 10 nt) che forniscono l'estremità 3'-OH necessaria alla polimerasi.
• DNA Ligasi: Sigilla i "nicks" (interruzioni) tra i frammenti. Utilizza ATP per creare il legame fosfodiesterico tra l'estremità 3'-OH e quella 5'-fosfato.
• Topoisomerasi I: Crea una rottura a singolo filamento reversibile che permette lo srotolamento del DNA. Non richiede ATP.
• Topoisomerasi II: Crea una rottura a doppio filamento per districare le eliche. Richiede ATP.
• PCNA: tiene la polimerasi legata al DNA aumentandone la processività.
• Caricatore della pinza: complesso proteico che usa ATP per caricare la pinza sul DNA.
A causa dell'andamento antiparallelo dei filamenti, la replicazione è asimmetrica.
• Filamento Leader (Guida): Sintetizzato in modo continuo in direzione 5' → 3'.
• Filamento Ritardato (Lagging): Sintetizzato in modo discontinuo tramite i frammenti di Okazaki. Ogni frammento richiede un nuovo primer di RNA.
Negli eucarioti abbiamo origini di replicazione multiple per velocizzare il processo.
In ogni origine di replicazione si forma il complesso prereplicativo (pre-RC), formato da:
- ORC: riconosce i punti di origine della replicazione sul DNA.
- Cdc6 e Cdt1: proteine che aiutano a caricare l’elicasi MCM sul DNA.

Inizio

Quando il DNA è pronto ad essere duplicato le chinasi CDK e DDK l’elicasi MCM, che così si attiva ed apre il doppio filamento di DNA e permette alla DNA polimerasi di iniziare la replicazione.
Il sistema è progettato per evitare duplicazioni multiple dello stesso segmento di DNA poiché non si può riformare il pre-RC su quella stessa origine fino al ciclo successivo.
Poiché la DNA polimerasi richiede un primer, l'estremità finale del filamento ritardato non può essere completata. Per questo motivo esiste la Telomerasi: enzima con attività di trascrittasi inversa che contiene uno stampo di RNA interno ed allunga le estremità dei cromosomi con una sequenza ripetuta, ma nella maggior parte dei casi non riescono a stare al passo con la replicazione della cellula, per cui si ha accorciamento dei telomeri.
Le estremità telomeriche si ripiegano per proteggere il DNA dai sistemi di riparazione che lo scambierebbero per un danno e in più sono protette dal complesso sheltrin.