Duplicazione del DNA


Fu il Novecento la culla delle più valide ricerche e di numerosi esperimenti condotti sul DNA. Il lavoro di personaggi come Griffith, Avery, Hershey, Chase, Chargaff e Franklin fu raccolto dallo statunitense James Watson e dall’inglese Fancis Crick i quali, nel 1953, definirono la struttura di quest’importantissima biomolecola.
“We had found the secret of life”, “Noi avevamo scoperto il segreto della vita” esclamò Crick: ma in realtà i due studiosi avevano svelato qualcosa di molto più prezioso, ovvero il segreto dell’ereditarietà e della modalità con cui il patrimonio genetico si riproduceva e trasferiva da cellula a cellula.

Descrizione della duplicazione


Alla fine degli anni 50’ erano stati proposti tre modelli per la replicazione del DNA:
• In base al modello conservativo la molecola originaria viene mantenuta e si assiste alla sintesi di un’intera molecola nuova

• In base al modello dispersivo la sintesi del DNA origina due molecole i cui filamenti sono costituiti da frammenti di DNA vecchio e neosintetizzato


• In base al modello semiconservativo ciascuna molecola di DNA era costituita da un filamento appartenente alla vecchia molecola e uno nuovo

Già dal momento della scoperta della struttura del DNA, Watson e Crick postularono che la sua modalità di replicazione fosse semi0conservativa: infatti, la struttura dei due filamenti e la complementarità delle basi azotate, lasciava già intuire che le due catene polinucleotidiche si sarebbero slegate e avrebbero avuto la funzione di stampo per un nuovo filamento. Solo nel 1958, grazie all’ esperimento di Meselson e Stahl si ebbe la dimostrazione definitiva del modello semiconservativo. I due fecero crescere dei batteri Escherichia coli in un terreno di coltura ricco dell'isotopo pesante 15N (scelsero l’azoto perché è presente nelle basi azotate). In questo modo il DNA presente nei batteri era un "DNA pesante", poiché inglobava atomi di azoto più pesanti della norma. I due scienziati si assicurarono di mantenere i batteri in questo terreno di coltura per un tempo tale da garantire che tutto il DNA fosse effettivamente pesante. Alcuni batteri furono poi prelevati, lisati e, con opportune tecniche di laboratorio, venne estratto il loro DNA. Quest'ultimo venne aggiunto ad una provetta contenente una soluzione concentrata di Cloruro di Cesio (CsCl). La provetta fu poi centrifugata e dopo un po’di tempo, in queste condizioni, nella provetta si formò un gradiente di densità: il DNA migrò per fermarsi nella regione della soluzione che ha densità uguale alla sua. Fu poi messo in evidenza in seguito all'introduzione di particolari sostanze che si legano ad esso e divengono visibili se illuminate da luce ultravioletta. Ciò che si vide sperimentalmente fu una banda verso il fondo della provetta. A questo punto alcuni batteri furono trasferiti dal primo terreno di coltura in un nuovo terreno "standard", in cui cioè era presente 14N anziché 15N. I microorganismi metabolizzarono l'azoto includendolo nelle basi azotate dei nucleotidi che andranno a formare le nuove eliche di DNA. Trascorsi venti minuti, ovvero il tempo necessario per la formazione di una nuova generazione di batteri (ovvero replicazione del DNA), alcuni batteri furono prelevati dal terreno "standard", furono lisati e venne estratto il DNA. In seguito ad una centrifugazione in gradiente di densità si ottenne un'unica banda posta in posizione superiore rispetto a quella del caso precedente: il DNA era quindi più leggero. Questi risultati esclusero subito la possibilità della replicazione conservativa, poiché, per confermare questo modello, a seguito dell'esperimento avrebbero dovuto formarsi due catene molto diverse l'una dall'altra (che avrebbero formato due bande e non una, come invece accadde): una più in basso, quindi pesante, identica a quella di partenza, e una in alto nella provetta, leggera, fatta solo dai filamenti di nuova sintesi. Tuttavia non poteva ancora essere escluso il modello dispersivo, poiché il peso intermedio del nuovo filamento poteva essere dovuto all'alternanza sulle eliche del DNA di zone con l'azoto leggero e zone con l'azoto pesante. Trascorso il tempo necessario per la successiva replicazione del DNA, venne ripetuta la suddetta procedura. In questo caso si ottennero due bande: la prima in posizione nettamente superiore a quelle ottenute nei casi precedenti, la seconda nella stessa posizione di quella dell'esperimento precedente. Questo risultato escludeva, dunque, il modello dispersivo: la formazione di due bande distinte dimostrava che non vi era un rimescolamento casuale di parti di DNA leggero e parti di DNA pesante, infatti in questo caso si sarebbe formata solamente una banda che, di generazione in generazione, si sarebbe depositata sempre più in alto, fino a raggiungere la zona corrispondente alla densità del 14N (poiché il terreno di coltura era sempre il 14N, leggero). Invece la formazione di due bande nette dimostrava che il filamento pesante si andava conservando sempre uguale (appaiato sempre ad un filamento leggero) per cui la molecola di DNA col filamento pesante si depositava sempre nello stesso punto. Di generazione in generazione, la banda di DNA leggero si inspessiva (perché si continuava a far riprodurre i batteri nell'azoto leggero), ma la banda di DNA intermedio si conservava sempre.


Detto ciò analizziamo nello specifico come avvengono questi determinati passaggi che portano alla formazione di una “seminuova” molecola di DNA.
Il processo ha luogo prima della divisione cellulare, sia nelle cellule eucariotiche che procariotiche, all’interno del nucleo: per quanto riguarda le prime avviene durante la fase S dell’interfase, mentre per i secondi simultaneamente alla divisione cellulare. Perché il DNA si duplichi deve interagire con un enorme complesso proteico, detto complesso di duplicazione, che catalizza le reazioni necessarie e contiene molteplici proteine che svolgono diverse funzioni. In passato si riteneva che il complesso di duplicazione si muovesse lungo la molecola di DNA, dati recenti invece suggeriscono che sia il DNA a scorrere attraverso il complesso di duplicazione, che rimane fermo
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