Replicazione del DNA - Procarioti ed eucarioti

Procarioti

Per iniziare la replicazione, il DNA deve aprirsi in un punto specifico chiamato origine di replicazione (Ori).
•Nei batteri, esiste un’unica origine (oriC) con molte coppie di basi A-T, più facili da separare rispetto alle G-C. Una proteina chiamata DnaA si lega a questa sequenza e apre la doppia elica. Poi, l’elicasi DnaB, aiutata da DnaC, separa i due filamenti come una cerniera.
•Negli eucarioti, i cromosomi sono molto più grandi, quindi hanno molte origini di replicazione, ovvero sequenze ricche di A=T che sono più semplici da separare. Qui entra in gioco un complesso proteico chiamato ORC che riconosce i siti di origine. Su ogni sito di origine individuato, si aggiungono tutti i fattori di replicazione dando vita al pre-replication complex, che “prepara” il DNA per la replicazione. Ogni origine può essere utilizzata una sola volta per ciclo cellulare, per evitare di duplicare uno stesso tratto. Tale compito è affidato al licensing factor.
Quindi, intervengono le elicasi che separano i due filamenti di DNA e formano delle bolle di replicazione, alle cui estremità abbiamo forcelle di replicazione. Avendo quindi le due estremità delle forcelle di replicazione, abbiamo una duplicazione in direzioni opposte, ovvero bidirezionale.
Una volta separati i due filamenti vengono mantenuti separati dalle SSB.
Man mano che il doppio filamento viene aperto, si possono generare delle tensioni. Questa tensione è alleviata dalle topoisomerasi (nei provarioti si chiama girasi), enzimi che tagliano temporaneamente il DNA: Topoisomerasi I: taglia un singolo filamento e Topoisomerasi II: taglia entrambi i filamenti. Il filamento tagliato scarica lo stress, dopodiché il legame fosfodiesterico viene ristabilito.

Polimerasi

A questo punto, la DNA polimerasi può ricopiare il filamento, ma per funzionare, ha bisogno di un punto di partenza su cui “attaccare” i nuovi nucleotidi. Entra in gioco l’enzima primasi che costruisce un piccolo pezzo di RNA chiamato primer, dal quale la polimerasi inizia a duplicare.
Gli enzimi principali della replicazione sono le DNA polimerasi, che aggiungono nucleotidi formando legami fosfodiesterici. L’energia deriva dall’idrolisi del pirofosfato che hanno i nucleotidi stessi prima di essere attaccati.
Negli eucarioti abbiamo 3 tipi di DNA polimerasi:
•Pol α: è la polimerasi che inizia ad aggiungere nucleotidi vicino al primer, formando un tratto ibrido. •Pol δ: sintetizza il filamento lento fatto dei frammenti di Okazaki con attività 3’→5’ esonucleasica, ovvero ripercorre il filamento all’indietro cambiando i nucleotidi sbagliati. Tale attività è anche chiamata correzione di bozze o proofreading. Se l’errore sfugge a questo meccanismo interviene il meccanismo di mismatch reapir che funziona allo stesso modo.
•Pol ε: sintetizza il filamento guida (leading strand) con attività 3’→5’ esonucleasica.
Anche nei Procarioti abbiamo 3 tipi di DNA polimerasi:
•Pol III: da DNA polimerasi principale che sintetizza i filamenti. È unica sia per il filamento guida che per quello tardivo poiché duplica entrambi contemporaneamente, tramite la formazione di un’ansia sul filamento tardivo in modo che orienta anche quello tardivo nella stessa direzione del filamento guida.
•Pol I: rimuove primer RNA e sostituisce con DNA.
•Pol II: coinvolta solo nella riparazione del DNA.
Negli eucarioti le polimerasi tendono a staccarsi dal filamento, per interviene la pinza scorrevole PCNA, caricata da RFC, che mantiene la polimerasi stabile sul DNA.