Acidi nucleici, struttura del DNA, replicazione

Struttura dei nucleotidi

I nucleotidi sono monomeri degli acidi nucleici. Gli acidi nucleici sono polimeri composti da monomeri detti nucleotidi: ogni nucleotide è formato da uno zucchero pentoso, da una base azotata e un gruppo fosfato.

Le basi azotate possono assumere due forme:

- struttura ad anello semplice: piramidina;

- struttura a doppio anello: purina.

Differenze tra DNA e RNA

Sia il DNA che l’RNA possono contenere quattro tipi di nucleotidi, che però si differenziano nel DNA e nell’RNA.

- Nel DNA lo zucchero è desossiribosio, nel RNA è presente il ribosio, con un atomo di O2 in più,

- Nel DNA compaiono 4 basi azotate: adenina (A), citosina (C), guanina (G) e timina (T).

Nell’RNA al posto della timina, c’è l’uracile (U).

Scoperta del materiale ereditario

I geni sono fatti di DNA.

All’inizio del 900 i genetisti avevano stabilito una relazione fra geni e cromosomi, ma furono necessari 50 anni per comprendere il ruolo importante del DNA.

La scoperta del materiale ereditario risale al 1869, quando il medico svizzero Friedrich Miescher identificò all’interno dei nuclei dei globuli bianchi una sostanza ricca di fosfato che chiamò nucleina.

Negli anni a seguire la chiamarono DNA, e circa nel 1920 gli scienziati scoprirono che i cromosomi sono fatti di DNA e proteine.

I biologi partivano dal presupposto che il materiale genetico:

- fosse presente in quantità differenti a seconda delle specie;

- avesse la capacità di replicarsi;

- agisca all’interno della cellula regolando lo sviluppo.

I biologi ponevano l’attenzione sulle proteine perché:

- sono biomolecole che hanno tantissime funzioni;

- sono presenti anche nel citoplasma;

- malattie genetiche e mutazioni effettuano una variazione nella produzione di esse.

Esperimenti di Frederick Griffith

All'inizio del Novecento il medico inglese Frederick Griffith sta cercando un vaccino in grado di combattere il batterio responsabile della polmonite: lo streptococcus pneumoniae.

Dai suoi esperimenti deriverà una delle prime scoperte sulla funzione del DNA.

Nel 1928 Griffith isola il batterio dal muco dei suoi pazienti e lo fa crescere in laboratorio all'interno di una capsula petri: qui osserva due popolazioni diverse:

-ceppo smooth (S): forma colonie lisce;

-ceppo rough (R): forma colonie rugose.

Il primo ceppo è virulento, cioè provoca la morte dei topi in cui viene iniettato, invece il secondo ceppo è innocuo e gli animali rimangono vivi quando ricevono i batteri.

Griffith sa che il calore uccide i batteri, per cui prova a riscaldare il ceppo S prima di iniettarlo nei topi.

Vuole capire se questa popolazione è virulenta anche quando i batteri sono morti e ciò che osserva è che: i batteri S uccisi dal calore sono innocui, i topi infatti non muoiono, ma la svolta dell'esperimento arriva quando due ceppi innocue cioè i batteri S uccisi e i batteri R sono iniettati nei topi, loro muoiono.

Il ceppo S deve quindi contenere qualche sostanza chimica che resiste al calore e che può passare da un batterio all'altro trasformando i batteri innocui in batteri virulenti.

Una volta trasmessa la virulenza si conserva nel tempo e si trasmette alle generazioni batteriche. Griffith chiama questa sostanza fattore di trasformazione.

Scoperta del fattore di trasformazione

La scoperta del fattore di trasformazione apre la strada a nuove domande: Qual è la natura chimica di tale sostanza e come si trasmette? La risposta arriverà qualche anno dopo grazie agli esperimenti di Avery, Hershey e Chase.
Il fattore di trasformazione è il DNA. La scoperta del fattore di trasformazione avvenne nel 1944.

Il medico canadese Oswald Avery e i suoi colleghi furono i primi a fornire una prova evidente che il fattore di trasformazione fosse il DNA, attraverso due tipi di indagine:

- esperimenti di eliminazione: sottoposero i campioni contenenti il fattore di trasformazione dello pneumococco a vari trattamenti per distruggere tipi diversi di molecole (proteine, lipidi, carboidrati e acidi nucleici) e controllavano se mantenessero la capacità di trasformazione.

Se si distrugge il DNA l’attività di trasformazione andava persa, ma ciò non avveniva quando si distruggono le proteine, carboidrati e lipidi.

- esperimenti di conferma: isolarono del DNA pruo da un campione che conteneva fattore di trasformazione dello pneumococco e dimostrarono che provocava la trasformazione batterica.

Fu pubblicato il resoconto e non ebbe la popolarità pensata per due motivi:

1) la genetica batterica era campo di studio nuovo;

2) molti scienziati pensavano che il DNA fosse un materiale troppo semplice per definirsi materiale genetico.

Nel 1928 Griffith scopre il fattore di trasformazione e nel 1944 Avery dimostra questa sostanza è il DNA.

Per convincere i ricercatori ancora dubbiosi Alfred Hershey e Martha Chase forniscono una prova ulteriore del fatto che il DNA è il materiale genetico.

Rispetto agli esperimenti precedenti Hershey e Chase introducono un nuovo elemento: il batteriofago T2, un virus che infetta i batteri di escherichia coli e che è costituito da DNA impacchettato in una capsula proteica.

Per replicarsi: il batteriofago T2 infetta una cellula ospite all'interno della quale inietta una porzione di se stesso, in seguito all'infezione la cellula si rompe e libera nuove particelle virali. Hershey e Chase si chiedono se il materiale iniettato all'interno della cellula, responsabile della replicazione, coincida con il DNA o con le proteine.

Per distinguere le due componenti virali gli scienziati le differenziano con isotopi radioattivi specifici: marcano lo zolfo delle proteine e il fosforo del DNA.

A questo punto dividono la cultura batterica di escherichia coli in due beute e infettano le cellule con i virus marcati.

Nella prima beuta inseriscono il batteriofago con le proteine marcate, nella seconda quello con la marcatura sul DNA.

Dopo qualche minuto dall'infezione il contenuto delle beute viene agitato in un frullatore, per far sì che le porzioni del virus che non sono penetrate nelle cellule batteriche si stacchino.

Le due soluzioni vengono poi sottoposte a centrifugazione, in questo modo le componenti più pesanti, cioè i batteri finiscono sul fondo, mentre le parti più leggere vanno a formare il liquido surnatante.

Hershey e Chase scoprono che le proteine marcate con lo zolfo sono rimaste in superficie, mentre il DNA marcato con il fosforo si trova sul fondo della provetta, dove ci sono i batteri.

Ciò significa che la porzione virale che penetra nel batterio è il DNA.

Gli esperimenti sul batteriofago T2 vengono pubblicati nel 1952 e contribuiscono l'identificazione del DNA come materiale genetico.

Struttura del DNA

È ormai chiaro che il DNA è il materiale genetico della cellula ed è contenuto nel nucleo, rimangono però ancora sconosciute: la struttura tridimensionale e la composizione chimica.

Nel 1950 quando il chimico austriaco Erwin Chargaff determina la composizione chimica e scopre che la composizione del DNA presenta alcune regolarità.

La quantità totale delle purine, ovvero le basi azotate adenina e guanina è pari a quella delle pirimidine, cioè timina e citosina.

Nel 1952 i biofisici inglesi Maurice Wilkins e Rosalind Franklin applicano la tecnica della cristallografia a raggi X, per stabilire la struttura tridimensionale di questo acido nucleico. Preparano i campioni di DNA: orientando le fibre in maniera molto regolare in modo da ottenere un risultato nitido all’analisi cristallografica.

A questo punto si ottengono delle immagini che suggeriscono che la molecola di DNA abbia una forma ad elica.

Grazie a queste scoperte il fisico inglese Francis Crick e il genetista americano James Watson compongono l'ultimo tassello della ricerca: i due scienziati costruiscono un modello tridimensionale coerente a tutte le proprietà della molecola scoperte dai colleghi.

Nel 1953 propongono per la molecola di DNA una struttura a doppia elica, come in una scala a pioli: due catene di zucchero desossiribosio e fosfato rappresentano i montanti, mentre l'appaiamento delle basi adenina timina e citosina guanina formano i pioli.

Replicazione del DNA

Il DNA è costituito da due catene polinucleotidiche appaiate fra loro e avvolte a formare una doppia elica. Ogni catena è formata da una sequenza di nucleotidi uniti da legami covalenti fra il gruppo fosfato legato al carbonio 5’ di un nucleotide e l’ossigeno legato al carbonio in 3’.

I legami covalenti si formano per condensazione tra un gruppo ossidrile (OH-) del desossiribosio e un gruppo fosfato (-OPO3-).

Le due catene sono complementari e antiparallele, infatti nel DNA sono tenute insieme da legami a idrogeno fra le basi.

L’appaiamento delle basi azotate avviene secondo regole costanti: A-T formano 2 legami a idrogeno, C-G formano 3 legami a idrogeno.

I due filamenti sono paralleli perchè sono orientati in direzioni opposte: ogni catena presenta un’estremità chiamata 5’, un gruppo fosfato (-OPO3-) e all’altra estremità chiamata 3’, un gruppo ossidrile (OH-).

La doppia elica invece va immaginata come una scala a pioli: due catene di zucchero desossiribosio e fosfato rappresentano i montanti, mentre l'appaiamento delle basi adenina timina e citosina guanina formano i pioli.

Dentro la cellula esiste il nucleo con all’interno il DNA.

Quando queste cellule si dividono devono anche garantire che le cellule figlie contengono la stessa quantità di DNA.

Il ciclo cellulare si compone:

- fase G1: costituisce la vita della cellula;

- fase S: avviene la duplicazione del DNA;

- fase G2: vengono duplicate sintetizzati tutti quegli organelli che servono poi a essere divisi nella successiva fase M (fase mitotica);

- fase M: divisione cellulare effettiva.

Esperimento di Meselson e Stahl

Siamo nel 1958, quando due studiosi Matthew Meselson e Franklin Stahl riuscirono, con un esperimento, a dare una risposta a dei dubbi che c’erano.

In quegli anni le ipotesi sulla replicazione del DNA erano tre:

- Teoria conservativa: dal DNA materno si originavano 2 DNA figli, in una cellula il DNA identico all’originale, nell’altra doveva essere sintetizzato da capo.

- Teoria semiconservativa: nella fase S, entrambi i filamenti originali, fungano da stampo per la cellula figlia, quindi entrambe le cellule riceveranno un filamento vecchio e uno nuovo.

- Teoria dispersiva: il DNA della cellula madre quando si avvicinava alla fase S, si frammentava e veniva riassemblato con frammenti nuovi sintetizzati.

Fecero crescere un ceppo batterico in un terreno di coltura contenente azoto radioattivo (N15), in maniera tale che all’interno delle basi azotate del DNA andasse a finire l’isotopo.

Ruppero la membrana di queste cellule e le inserirono in una soluzione di cloruro di cesio (CsCl), all’interno di una provetta, per fare una ripartizione densitometrica sulla base degli organuli contenuti all’interno della cellula. Videro che il materiale contenente l’isotopo si andava a disporre sul fondo perché era pesante.

Successivamente presero un ceppo batterico, lo esposero a un terreno di coltura contenente azoto (N14) e aspettarono 20 minuti.

Presero una quantità di questi batteri e ruppero la loro membrana e li inserirono insieme alla soluzione cloruro di cesio (CsCl) in una provetta.

Si aspettavano, se la teoria giusta fosse stata quella semiconservativa, che una parte di batteri che contenevano l’azoto radioattivo fosse nella parte più bassa (perchè è più pesante), e una banda più in alto che rappresentava la parte dei batteri contenenti l’azoto (N14)

Invece venne fuori un’unica banda che era a metà strada tra l’azoto 15 e l’azoto 14.

Arrivati a questo punto dell’esperimento la teoria conservativa viene scartata: non ottennero due bande, ma un’unica banda con una massa molare compresa fra 15 e 14.

Usando i batteri salvati, nel terreno di coltura dell’azoto 14, gli fecero fare una seconda divisione e rifecero lo stesso esperimento (lisi della cellula e soluzione di CsCl).

Se fosse venuta fuori un’unica banda leggermente più alta (più leggera), perchè mano a mano che aumenta l’azoto 14, quello radioattivo diminuisce, di conseguenza sarebbe stata giusta quella dispersiva.

Loro ottennero due bande, dopo 40 minuti dall’inizio dell’esperimento: una banda che rappresentava la via di mezzo fra azoto 14 e azoto 15 e un’altra banda che era fatta maggiormente da azoto 14.

Questo confermava che la teoria giusta era la semiconservativa: ad ogni passaggio dalla cellula fatta solo da azoto 15 a quelle fatte da azoto 14 e 15, se continui a fornire solo azoto 14, alla fine si hanno delle bande dove si perdono uno dei due e rimaneva solo azoto 14.

Processo di replicazione del DNA

La separazione dei due filamenti questa separazione avviene ad opera di un enzima chiamato il Helicase che va separare due filamenti di DNA creando una forcella di replicazione.

Ciascuna delle catene ormai separate costituirà il modello per creare un nuovo filamento di DNA. A questo punto vi è la necessità di un enzima che vada ad iniziare la nuova catena di DNA, questo enzima si chiama Primase.

E’ un enzima che va a comporre un piccolo pezzo di RNA indispensabile per attivare poi un secondo enzima, chiamato DNA polimerasi, che andrà a costituire la catena del DNA.

Questo piccolo frammento di RNA chiamato Primer da cui prende il nome la Primase, segna il punto di partenza per la costruzione di un nuovo filamento di DNA.

Il DNA polimerasi si lega al Primer e va a costruire il nuovo filamento di DNA. La particolarità della DNA polimerasi è che può solo aggiungere base azotate seguendo la direzione 5’-3’.

Quindi il primo dei due filamenti che viene replicato sarà fatto in maniera continuativa e per questo viene chiamato filamento di Leading Strand o Filamento Veloce.

L’altro filamento invece viene denominato Lagging Strand o Filamento Lento e non può essere realizzato nello stesso modo, questo perché il secondo filamento è orientato in maniera opposta rispetto al primo.

La DNA polimerasi potrà costruire questo filamento partendo da una serie di piccoli pezzi chiamati Frammenti di Okazaki.

Serve sempre l'RNA primasi, quell’enzima che va a costituire il primer di RNA che servirà a far partire la replicazione da parte della DNA polimerasi.

E senza il primer la DNA polimerasi non può lavorare perché non troverai il sito a cui agganciarsi per costruire il nuovo filamento.

Quindi ogni nuovo frammento del Lagging Strand viene anticipato da un primer di RNA, e poi la DNA polimerasi aggiungerà una breve serie di basi nella direzione 5’-3’.

Esattamente nella direzione opposta alla quale si sta invece aprendo la doppia elica di DNA.

Il prossimo primer verrà aggiunto lungo il Lagging Strand e un altro Frammento di Okazaki verrà costruito.

Una volta che tutto il filamento è stato replicato l'enzima Esonucleasi rimuove tutti i primer di RNA da entrambi i filamenti di DNA.

A questo punto un altro tipo di DNA polimerasi riempie le lacune che sono state lasciate dai primer rimossi, aggiungendo delle base azotate del DNA.

Gli enzimi DNA ligasi sigillano i frammenti di DNA: scorrono lungo i filamenti neoformati per andare a formare una doppia elica continua.

La replicazione del filamento lento avviene per aggiunta dei frammenti di Okazaki ai primer di RNA.

Funzione dei telomeri

Nel DNA lineare degli eucarioti dopo la rimozione del primer terminale non è più possibile sintetizzare il DNA che lo sostituisca.

Di conseguenza il nuovo cromosoma presenta a entrambe le estremità un pezzetto di DNA a filamento singolo.

Si attivano dei meccanismi che tagliano la porzione a filamento singolo, insieme a una parte a filamento doppio.

In molti eucarioti le estremità dei cromosomi portano delle sequenze ripetute chiamate telomeri. Nella specie umana questa sequenza è TTAGGG ed è ripetuta 2500 volte.

A questi tratti ripetuti si legano delle proteine che mantengono stabili le estremità del cromosoma.

Il DNA telomerico può perdere da 50 a 200 coppie di basi, dopo 20-30 divisioni i cromosomi non partecipano più alla divisione cellulare e la cellula muore. La perdita dei telomeri spiega perché le cellule non durano tutta la vita.

Alcune cellule (midollo osseo e cellule produttrici dei gameti) conservano il DNA telomerico: in queste cellule esiste un enzima, la telomerasi che catalizza l’aggiunta della sequenza telomerica eventualmente persa.

Questo enzima contiene una sequenza di RNA che funziona da stampo per la sequenza telomerica ripetuta.

Riparazione del DNA

Il DNA polimerasi compie tantissimi errori durante la replicazione, circa un errore ogni 106 basi replicate.

Le cellule dispongono di tre metodi di riparazione:

1) correzione di bozze: corregge gli errori mano a mano che la DNA polimerasi li compie;

2) riparazione delle anomalie di appaiamento: esamina il DNA subito dopo la replicazione e corregge gli appaiamenti sbagliati;

3) riparazione per escissione: rimuove le basi anomale dovute ad un agente chimico e le sostituisce con basi funzionali.

La DNA polimerasi I, un enzima che si occupa della correzione, se si accorge di un appaiamento sbagliato, toglie il nucleotide e introduce quello corretto.

Dopo che il DNA è stato replicato, una serie di proteine esamina la molecola in cerca di appaiamento sfuggiti alla correzione di bozze.

Il meccanismo di riparazione delle anomalie riconosce la base sbagliata, perché un filamento di DNA appena replicato subisce cambiamenti chimici.

Le molecole di DNA si possono danneggiare anche durante la vita, quindi, ci sono enzimi che ispezionano il DNA e quando trovano basi improprie, tagliano via il filamento difettoso.

Un altro enzima rimuove la base colpevole e quelle adiacenti, mentre la DNA sintetizza e attacca una nuova sequenza di basi.